Prenos plazmidov s konjugacijo med gramnegativnimi bakterijami

Procesi v donorski celici

Bakterijska konjugacija je mehanizem horizontalnega prenosa genov, ki vključuje konjugacijski pilus in T4SS. T4SS (bakterijski izločevalni sistem tipa IV) je izločevalni proteinski kompleks, najden v gram-negativnih ter gram-pozitivnih bakterijah in arhejah, ki omogoča prenos proteinov in DNA skozi celično membrano. ‎
Sposobnost donorske celice, da izvede konjugacijo, omogoča izražanje genov za prenos, ki so zapisani v tra regiji plazmida. Te geni kodirajo vse proteinske faktorje, ki so vključeni pri izdelavi konjugacijskega pilusa in T4SS potrebnega za formacijo paritvenega para. Prav tako so pomembne komponente relaksosoma, ki so potrebne za pripravo plazmida pred prenosom. Različna morfologija pilusov celicam omogoča konjugacijo v tekočini ali na trdni površini. F plazmid nosi zapis za tanek prožen pilus, ki ima cevasto strukturo s premerom okoli 8 μm in dolžino do 20 μm. Sestavljen je iz edinstvene proteinske podenote – F pilin oz. TraA. ‎
Donorske celice proizvajajo prožne piluse, ki so nenehno podvrženi ciklom iztegovanja in umikanja, s čimer preiskujejo okolico, ne glede na prisotnost prejemnih celic. Po vzpostavitvi stika s prejemno celico, pa retrakcija pilusa potegne celici skupaj in posledično se vzpostavi paritveni par. ‎
Iniciacija konjugacije zahteva sestavo in aktivnost proteinskega kompleksa relaksosoma, ki omogoča preoblikovanje plazmida pred njegovim prenosom. Preoblikovanje zajema rezanje na specifičnem mestu in verigi - na delu nic, ki se nahaja na začetku tra genov (oriT) in rezanje enoverižne DNA (T-veriga), ki bo kasneje prenešena. Te dve reakciji izvede TraI relaksaza, protein, ki je sestavljen iz transesterazne domene, ta katalizira reakcijo reza in DNA helikazne domene, ki odvije plazmidno DNA. Aktivnost TraI nadzorujejo pomožni proteini, kot so IHF (integration host factor) – faktor integracije gostitelja in plazmidna proteina TraY in TraM, ki imata izrazito vlogo v formaciji relaksosoma in aktivnost pri oriT. ‎
Nastali nukleoproteinski kompleks, sestavljen iz T-verige in kovalentno vezanega TraI, se mora prenesti do konjugativnih por za prenos. To omogočajo sklopitveni proteini tipa IV (T4CP), ki so zasidrani v celični membrani in neposredno komunicirajo z relaksosomom. Tvorijo heksamerne strukture na T-verigi, ki se aktivno prenesejo skozi konjugacijske pore med prenosom. ‎
Ekspresijo tra genov regulirajo številni faktorji kot so plazmidni proteini, proteini gostiteljske celice, stopnja celičnega cikla in okoljske razmere. Večina tra genov je zbranih v enem operonu, ki jih kontrolira PY promotor. Ekspresija transfernih genov sledi specifični regulatorni kaskadi, ki se začne s proizvodnjo traJ proteina, ki aktivira PY promotor in transkripcijo tra operona. Najprej se prepiše traJ, ki kodira regulatorni protein TraJ, ta aktivira PM promotor, kar povzroči produkcijo traM proteina relaksosoma. Ta regulatorna kaskada tako povzroči izražanje vseh genov, ki so vključeni v izdelavo konjugacijskega pilusa, T4SS in relaksosoma. ‎
Nekatere gram-negativne bakterije ekspresijo tra genov regulira z mehanizmom zaznavnaje kvoruma (QS – quorum-sensing). Bakterije zaznavajo in sproščajo signalne molekule, imenovane avtoinduktorji, katerih koncentracija se poveča glede na gostoto celic. Gram-negativne bakterije kot avtoinduktorje uporabljajo acilirane homoserin laktone (AHL). Zaznavanje minimalne koncentracije AHL vodi do spremembe izražanja genov. ‎
Ekspresija tra genov je nadzorovana s kompleksnimi regulatornimi procesi, ki vključujejo aktivnost plazmidnih in kromosomskih faktorjev donorske celice. Ta regulacija omogoča nadzor za učinkovitost konjugacije v povezavi z življenjskim ciklom plazmida in fiziologijo gostitelja kot odziv na okoljske razmere in populacijske interakcije.

Konjugacija v naravnih habitatih: primer bakterijskih biofilmov

Znano je, da prenos genov s konjugacijo prispeva h genetski dinamiki bakterijskih populacij, ki živijo v različnih okoljih, vključno s tlemi, na površinah rastlin, v vodi in odpadnih vodah, pa tudi v bakterijskih skupnostih, povezanih z rastlinskimi ali živalskimi gostitelji. Bakterije na splošno veljajo za planktonske enocelične organizme, vendar v naravnem in kliničnem okolju pogosto živijo v kompleksnih strukturah, imenovanih biofilmi. Biofilmi nudijo bakterijam zavetje pred zunanjimi nevarnostmi, vendar je bilo tudi predlagano, da nudijo nišo, ki olajša širjenje determinant odpornosti na zdravila s konjugacijo

Biofilm kot niša, ki spodbuja konjugacijo bakterij

Organizacija sestavin matriksa biofilma vpliva na hitrost prenosa plazmidov. Polisaharidi lahko na primer omejijo difuzijo DNA in ovirajo stik med celicami dajalkami in prejemnicami. Zunajcelična DNA (eDNA) deluje kot skupni adhezin, ki približa celice za konjugacijo. Tako različne sestave matriksa ustvarjajo različna mikrookolja, ki vplivajo na pretok genov s konjugativno izmenjavo.

Vpliv strukture biofilma na konjugacijo

Učinkovitost konjugacije je odvisna od arhitekturne strukture biofilmov, na katero vplivajo dejavniki, kot so bakterijske vrste in okoljski pogoji. Glede na mikroskopske študije poteka konjugacija predvsem na robovih biofilmov, kar kaže na majhen prodor v globlje plasti. Kljub temu znanju ostaja še vedno negotovo, kako kemični gradienti znotraj teh skupnosti vplivajo na presnovo bakterij in genetsko raznolikost, zlasti ko gre za njihovo povezavo s konjugacijo.

Vpliv konjugativnih plazmidov na tvorbo biofilma

Konjugirani plazmidi, ki pogosto nosijo gene za spodbujanje pritrjevanja na površino, prav tako povečujejo nastanek biofilma. Ko je plazmid v gostiteljski celici, lahko spremeni izražanje genov in s tem vpliva na zgradbo in zorenje biofilmov. Vendar je treba mehanizme, ki so vključeni v te spremembe, še naprej raziskovati, zlasti med različnimi vrstami gostiteljev.

Vpliv zdravljenja z antibiotiki na konjugacijo v biofilmih

Na dinamiko biofilma in prenos genov vpliva zdravljenje z antibiotiki. Antibiotiki pod najnižjimi inhibitornimi koncentracijami (sub-MIC) lahko spodbujajo nastanek ali povečajo pogostost konjugativnih dogodkov, hkrati pa z bolj odpornimi skupnostmi povečujejo odpornost proti protimikrobnim sredstvom. Poskusi slikanja v realnem času razkrivajo, da antibiotiki morda služijo predvsem kot gonilna sila za selekcijo po prenosu in ne kot neposredni spodbujevalci konjugacije. Zdravljenje z antibiotiki spremeni strukturo biofilma in tako vpliva na učinkovitost prenosa plazmidov. Nekatera zdravila motijo komunikacijo med celicami ali zavirajo proizvodnjo matriksa, kar vpliva na pogostost konjugacije in prostorsko razporeditev v biofilmu. Po drugi strani pa nekateri antibiotiki povzročijo lizo bakterijskih celic v biofilmih, pri čemer se sproščajo prosti fragmenti DNA v okolje, kjer jih lahko prevzamejo druge bakterije z naravno sposobnostjo ali procesi transformacije. Zato imajo protimikrobna sredstva dvojno vlogo, in sicer kot modulatorji genske izmenjave znotraj biofilmov in kot gonilna sila za horizontalni prenos genov med različnimi vrstami ali rodovi.Razumevanje teh odnosov je pomembno za razvoj strategij za obvladovanje okužb, povezanih z biofilmskimi skupnostmi, ki so odporne proti več zdravilom. Mikrofluidika se lahko uporablja za preučevanje, kako se geni širijo v biofilmih. Nedavna študija je pokazala, da je način, kako se geni premikajo skozi biofilm, nadzorovan z njegovo strukturo. Dejstvo, da lahko zaradi njih bakterije, odporne na antibiotike, bolj verjetno delijo gene za odpornost, pomeni, da moramo razumeti, kako zdravila vplivajo na prenos genov znotraj teh kolonij.