Širjenje odpornosti proti antibiotikom med talnimi bakterijami

Uvod

Plazmidi, zunajkromosomske (običajno) krožne molekule DNA, spadajo poleg transpozonov, fagov in integronov med mobilne genetske elemente (MGE). To pomeni, da med bakterijami omogočajo prenos genov z različnimi funkcijami, ki jim koristijo pri preživetju in prilagajanju na vedno spreminjajoče se okolje, kot so detoksifikacija težkih kovin, fiksacija dušika in odpornost proti antibiotikom.

Slednja predstavlja resno okoljsko težavo, saj so antibiotiki v današnjem svetu izjemnega pomena - inhibirajo razmnoževanje mikroorganizmov in zdravijo bakterijske okužbe. Prekomerna raba antibiotikov vodi v razvoj genov, ki nosijo zapis za odpornost proti antibiotikom (ARG), ki so dandanes zelo razširjeni v okolju. Plazmidi so glavni vektorji za prenos ARG med bakterijami, in sicer po mehanizmu horizontalnega prenosa genov (HGT) - s transformacijo, konjugacijo ali transdukcijo.

Ker igra prst pomembno vlogo pri delovanju biosfere, je raziskovanje prenosa ARG v prsti preko plazmidov izjemnega pomena za ohranjanje javnega zdravja.

Izolacija plazmidne DNA iz okoljskih vzorcev

Metagenomske analize

Za izolacijo in karakterizacijo plazmidov se tradicionalno uporabljajo predvsem metode, ki temeljijo na gojenju mikrobnih kultur. Pri vzorcih, pridobljenih iz okolja (na primer prsti ali morskih ekosistemov), pa je zaradi kompleksnosti mikrobnih združb to pogosto preveč zahtevno; ocenjeno je, da je le približno 1 % mikroorganizmov primeren za gojenje v gojišču.

V zadnjih letih se je razvil nov pristop, metagenomika, ki temelji na sekvenciranju in analizi mešanice vseh mikrobnih genomov (metagenomov), prisotnih v vzorcu iz okolja. Ponuja nam vpogled v zgradbo mikrobnih skupnosti in nam pomaga identificirati posebne genetske elemente. Težava nastopi pri plazmidni DNA, saj predstavlja le majhen delež celotne DNA in je verjetnost kontaminacije s kromosomsko DNA zelo visoka.

Za izolacijo plazmidov iz okoljskih vzorcev se je razvilo več različnih postopkov in dva najbolj obetavna sta opisana v nadaljevanju. Obema je skupen prvi korak po ekstrakciji metagenomske DNA: odstranitev genomske (kromosomske) DNA.

Odstranitev genomske DNA

Za izolacijo plazmidne DNA se metagenomsko DNA izpostavi od ATP-odvisni DNazi, PSD (plasmid-safe DNase). Ta encim razgradi zgolj genomsko DNA, krožno plazmidno DNA pa ohrani intaktno. Kasneje se lahko prisotnost genomske DNA sproti preverja s PCR analizo 16S rRNA gena; ker ni znano, da bi bil le-ta prisoten pri plazmidih, je pri analizi uporabljen kot indikator genomske DNA.

TRACA

TRACA (transposon aided capture method) je metoda, ki omogoča izolacijo plazmidov iz metagenomskih DNA ekstraktov in njihovo kasnejše vzdrževanje v gostiteljskih vrstah, na primer E. coli. Njena prednost je, da lahko z njo uspešno izoliramo tudi plazmide, ki ne vsebujejo konvencionalnih selekcijskih markerjev.

Po odstranitvi genomske DNA sledi in vitro insercija transpozonov z elementom EZ-Tn5, ki vsebuje selekcijski marker in mesto ori za E. coli. Plazmide se nato s transformacijo vstavi v nadomestne gostitelje, bakterije E. coli. Sledi izolacija plazmidov in sekvenciranje.

Seveda ima tudi ta metoda svoje omejitve, na primer ne moremo identificirati prvotne gostiteljske vrste, prav tako lahko transpozoni inaktivirajo iskane gene.

MDA

Metoda MDA (multiplex displacement amplification) temelji na amplifikaciji očiščene plazmidne DNA, saj so pri sekvenciranju potrebne dokaj velike količine iskane DNA. Plazmidno DNA se selektivno amplificira s phi29 polimerazo. Rezultat je zbirka konkatemer, velikih molekul DNA, ki vsebujejo več zaporednih kopij plazmidne DNA. Sledi sekvenciranje DNA, na primer Illumina sekvenciranje.

Mehanizem prenosa ARG s plazmidi

Pri širjenju ARG preko plazmidov je problematična predvsem njihova sposobnost, da hitro pridobijo tuje gene in jih lahko prenesejo na širok spekter gostiteljev, tudi v druge mikrobne skupnosti.

Plazmidi, ki sodelujejo pri širjenju ARG, imajo pomožne regije, sestavljene iz enega ali več genov z odpornostjo na antibiotike ter mobilnih elementov. Mobilni genetski elementi se lahko premikajo v ali med posameznimi DNA molekulami, to so insercijske sekvence (IS), prestavljivi (transposable) genetski elementi (Tn) in genske kasete (In). Mobilni genetski elementi, ki se premikajo med bakterijskimi celicami pa so plazmidi sami.

Horizontalni prenos genov poteka v treh korakih. Začne se z iniciacijo, tej sledi transfer genskega materiala v celico in konča se z integracijo pridobljenega genskega materiala v genotip receptorske celice.

Med plazmidi je najbolj pogost način prenosa genov z odpornostjo na antibiotike s konjugacijo. Pri konjugaciji se genski material med bakterijami prenese preko fizičnega stika med celicami.

Prenos se začne na mestu oriT na plazmidu. Proteini TraI, TraM in TraY sestavljajo relaksosom, ki se skupaj z IHF (integration host factor) veže na oriT. Pri tej vezavi sodelujejo še pomožni proteini in encim relaksaza. Sklopitveni protein tipa IV pa povezuje relaksosom s paritvenim kompleksom, ki tvori paritveni kanal med receptorsko in prejemniško celico. Encim relaksaza v oriT zareže DNA, plazmid spremeni konformacijo iz zvite v krožno sproščeno. Relaksaza skupaj s sklopitvenim proteinom vodi verigo T skozi paritveni kanal v prejemniško celico.

Ko se veriga T DNA prenese v prejemniško celico, se enoverižna DNA pretvori v dvoverižno, prenešeni geni se tako lahko začnejo izražati v prejemniški celici (Slika 1).

Prenos in širjenje ARG med talnimi bakterijami

Prisotnost ARG v okolju

ARG najdemo v številnih okoljih, tako močno onesnaženih z antibiotiki kot popolnoma neokrnjenih, na primer v polarnih regijah in na morskem dnu (Slika 2).

Prenos ARG poteka pri bakterijah zaradi energijsko potratnega mehanizma konjugacije predvsem v tleh, bogatih s hranilnimi snovmi, najdemo pa ga tudi v bakterijskih skupnostih globoko pod zemeljskim površjem.

Veliko Gram-negativnih bakterij, kot so Pseudomonas, Acinetobacter in Stenetrophomonas, je istočasno razvilo odpornost na različne antibiotike. Plazmidi, ki sodelujejo pri prenosu ARG, pa so bili odkriti tudi pri Gram-pozitivnih bakterijah, kar pomeni, da se ARG lahko prenašajo tako med Gram-negativnimi kot tudi Gram-pozitivnimi bakterijami.

Vpliv antibiotikov na širjenje ARG

Prekomerna raba antibiotikov v zdravstvu in živinoreji vodi do zastajanja ostankov antibiotikov v kliničnih okoljih, prsti kmetijsko obdelanih površin, čistilnih napravah in drugod. To predstavlja velik problem, saj so ostanki antibiotikov lahko strupeni za organizme, hkrati pa prispevajo k širjenju ARG.

Najpogosteje ljudem predpisani antibiotiki - betalaktami, kinoloni in metotreksat - se velikokrat znajdejo v odpadnih vodah bolnišnic in predvsem gospodinjskih odpadnih vodah, kar močno obremeni lokalne čistilne naprave; te lahko postanejo žarišče bakterijskega horizontalnega prenosa genov in proti antibiotikom odpornih bakterij (ARB), ki imajo pogosto več različnih ARG. Raziskava vzorcev blata iz čistilnih naprav je pokazala prisotnost velikega števila MGE, tudi plazmidov.

V bolnišnicah so sicer z odstranjevanjem antibiotikov iz odpadnih vod precej uspešni (74-81%), se pa ta delež razlikuje med posameznimi tipi antibiotikov; učinkovitost odstranjevanja betalaktamskih antibiotikov je tako precej večja kot pri ofloksacinu.

Tudi v kmetijstvu so ARG vse bolj prisotni, njihov glavni vir so živalski iztrebki. Uporaba amoksicilina na farmah s perutnino je povzročila kontaminacijo okolja (prsti, odpadnih vod, krme) z blaNDM (bla geni nosijo zapis za encime, ki omogočajo bakterijam odpornost proti β-laktamskim antibiotikom) in širjenje bakterij, ki nosijo zapis za ta ARG. Študija mcr-1-pozitivnih sevov E. coli iz perutnine je dokazala, da so le-ti odporni proti večim zdravilom; več kot 88,24% izolatov je vsebovalo gene blaTEM ter gene, odporne proti tetraciklinu (tetA in tetB) ter sulfonamidu (sul1, sul2, sul3).

Vpliv drugih dejavnikov na širjenje ARG

Na prenos in širjenje ARG preko plazmidov v okolju vplivajo različni dejavniki, na primer minerali v prsti, pa tudi taki, ki so posledica okoljskih onesnaževalcev, na primer težkih kovin in herbicidov, ter celo mikroplastika v vodnih in zemeljskih okoljih.

Raziskave ARG in težkih kovin so pokazale, da igrajo slednje pomembno vlogo pri povečanju integracije ARG pri bakterijah v prsti kmetijskih površin. Nanodelci bakrovega oksida in bakrovi ioni lahko olajšajo konjugativni prenos ARG; podoben vpliv imajo kadmijevi ioni ter visoke koncentracije nanodelcev Fe₂O₃. Visoke koncentracije kovin v prsti vplivajo na sestavo bakterijskih skupnosti.

H kontaminaciji okolja z ARG močno prispeva tudi uporaba organskih gnojil, s katerimi se bogati obdelovalne površine; če so poleg gnojil prisotni antibiotiki v nizkih koncentracijah, je horizontalni prenos genov še večji. Uporaba gnojil ne prispeva zgolj k večji frekvenci prenosa ARG, temveč tudi k nastanku novih različic mobilnih genetskih elementov.

Zanimivo lahko na prenos ARG vplivajo tudi določeni organizmi, kot so praživali in deževniki.

Izbrana primera ARG

Geni z zapisom za odpornost proti kinolonu (qnr)

Kinoloni so skupina sintetičnih antibiotikov, ki zavirajo delovanje DNA-giraze in topoizomeraze IV. Uporabljajo se pri zdravljenju infekcij gram-negativnih bakterij (npr. pri Enterobacteriaceae). Do sedaj je bilo na plazmidih in bakterijskih kromosomih odkritih vsaj 100 variant genov z odpornostjo proti kinolonom. Ti so razvrščeni v 5 družin: qnrA, qnrB, qnrC, qnrD in qnrS. qnrB izvira iz gozdnih tal, qnrS pa iz gospodinjskih in medicinskih odpadnih vod.

Do sedaj so bili potrjeni trije mehanizmi širjenja odpornosti proti kinolonom - z mutacijami genov, ki zapisujejo za DNA girazo in topoizomerazo, z zmanjšanjem koncentracije fluorokinolonov v celici in s plazmidom posredovanim prenosom genov, ki zapisujejo za odpornost proti kinolonom. V primeru mutacij se lahko te kopičijo in s selekcijo omogočajo nastanek močno odpornih sevov. V primeru s plazmidi posredovane odpornosti je nivo pridobljene odpornosti proti fluorokinolonom zelo nizek, a že ta nizek nivo odpornosti predstavlja že mutiranim sevom z višjo odpornostjo prednost in na tak način spodbuja selekcijo močno odpornih mutiranih sevov.

Znanstveniki so odkrili tudi sočasno prisotnost genov z odpornostjo različne antibiotike v različnih bakterijskih sevih (na primer soobstoj odpornosti na fluorokinolone, aminoglikozide in sulfametaksazole pri E. coli in (Klebsiella spp.), ter iz tega sklepali, da je bila pridobitev teh genov z odpornostjo proti antibiotikom posredovana s plazmidi.

Geni z zapisom za odpornost proti tetraciklinu (tet)

Tetraciklini so družina antibiotikov, ki inhibirajo sintezo proteinov s tem, da preprečijo vezavo aminoacil-tRNA na ribosomski receptor. Uporabni so tako v boju proti Gram-pozitivnim kot Gram-negativnim bakterijam.

Raziskava vzorcev živalskih iztrebkov, gnojil in prsti na farmi kokoši nesnic je potrdila prisotnost genov z zapisom za odpornost proti tetraciklinu tetA, tetM, tetQ in tetX. Poleg tega so odkrili še 12 drugih ARG, na primer za odpornost proti sulfonamidu (sul1, sul2) in betalaktamu (blaTEM).

Že omenjen tetX, ki kodira zapis za Tet(X) proteine, flavinske monooksigenaze, ki katalizirajo degradacijo tetraciklinov, so odkrili tudi pri bakterijah E. coli in Acinetobacter baumannii v človeških, živalskih in okoljskih vzorcih na Kitajskem, v Singapurju in Pakistanu. Natančneje gre za gena tet(X3) in tet(X4), ki nosita zapis za odpornost proti tigeciklinu (tetraciklin). Mehanizmi za odpornost proti tigeciklinu naj bi bili omejeni na kromosomske mutacije, ki se med bakterijami ne morejo prenašati; nedavno odkritje omenjenih genov, ki pa ju prenašajo plazmidi, to hipotezo ovržejo, kar predstavlja veliko grožnjo uporabi tigeciklina v kliničnem oziru. Poleg tega so pri študiji v Pakistanu odkrili soobstoj gena mcr-1, ki nosi zapis za odpornost proti kolistinu, pri treh preučevanih bakterijskih sevih.

Zaključek

Geni, ki nosijo zapise za odpornost proti antibiotikom (ARG), se zaradi prekomerne rabe in kopičenja ostankov antibiotikov v okolju hitro širijo med bakterijami, kar ima negativne posledice na javno zdravje. ARG so v velikih količinah prisotni predvsem na območjih, ki jih naseljuje in obdeluje človek, vendar so zaradi visokega deleža prenosa genov med bakterijami prisotni tudi v bolj odmaknjenih okoljih. Čeprav je izolacija plazmidne DNA iz okoljskih vzorcev velikokrat zahtevna, je razumevanje mehanizmov prenosa ARG in identifikacija le-teh ključna za zajezitev nadaljnjega razvoja odpornosti proti antibiotikom.

Viri

1. Aminov, Rustam. ‘Horizontal Gene Exchange in Environmental Microbiota’. Frontiers in Microbiology 2 (26 July 2012): 158. https://doi.org/10.3389/fmicb.2011.00158.

2. Brown Kav, Aya, Itai Benhar, and Itzhak Mizrahi. ‘A Method for Purifying High Quality and High Yield Plasmid DNA for Metagenomic and Deep Sequencing Approaches’. Journal of Microbiological Methods 95, no. 2 (1 November 2013): 272–79. https://doi.org/10.1016/j.mimet.2013.09.008.

3. Dib, Julián R., Martin Wagenknecht, María E. Farías, and Friedhelm Meinhardt. ‘Strategies and Approaches in Plasmidome Studies—Uncovering Plasmid Diversity Disregarding of Linear Elements?’ Frontiers in Microbiology 6 (26 May 2015). https://doi.org/10.3389/fmicb.2015.00463.

4. Jones, Brian V., and Julian R. Marchesi. ‘Transposon-Aided Capture (TRACA) of Plasmids Resident in the Human Gut Mobile Metagenome’. Nature Methods 4, no. 1 (January 2007): 55–61. https://doi.org/10.1038/nmeth964.

5. Jørgensen, Tue Sparholt, Zhuofei Xu, Martin Asser Hansen, Søren Johannes Sørensen, and Lars Hestbjerg Hansen. ‘Hundreds of Circular Novel Plasmids and DNA Elements Identified in a Rat Cecum Metamobilome’. PLOS ONE 9, no. 2 (4 February 2014): e87924. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0087924.

6. Kav, Aya Brown, Goor Sasson, Elie Jami, Adi Doron-Faigenboim, Itai Benhar, and Itzhak Mizrahi. ‘Insights into the Bovine Rumen Plasmidome’. Proceedings of the National Academy of Sciences 109, no. 14 (3 April 2012): 5452–57. https://doi.org/10.1073/pnas.1116410109.

7. Li, L. L., A. Norman, L. H. Hansen, and S. J. Sorensen. ‘Metamobilomics – Expanding Our Knowledge on the Pool of Plasmid Encoded Traits in Natural Environments Using High-Throughput Sequencing’. Clinical Microbiology and Infection 18 (1 July 2012): 8–11. https://doi.org/10.1111/j.1469-0691.2012.03862.x.

8. Meng, Miaoling, Yaying Li, and Huaiying Yao. ‘Plasmid-Mediated Transfer of Antibiotic Resistance Genes in Soil’. Antibiotics 11, no. 4 (14 April 2022): 525. https://doi.org/10.3390/antibiotics11040525.

9. Mohsin, Mashkoor, Brekhna Hassan, Willames M. B. S. Martins, Ruichao Li, Sabahat Abdullah, Kirsty Sands, and Timothy R. Walsh. ‘Emergence of Plasmid-Mediated Tigecycline Resistance Tet(X4) Gene in Escherichia Coli Isolated from Poultry, Food and the Environment in South Asia’. Science of The Total Environment 787 (15 September 2021): 147613. https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2021.147613.

10. Salah, Fortune Djimabi, Serge Théophile Soubeiga, Abdoul Karim Ouattara, Adodo Yao Sadji, Amana Metuor-Dabire, Dorcas Obiri-Yeboah, Abiba Banla-Kere, Simplice Karou, and Jacques Simpore. ‘Distribution of Quinolone Resistance Gene (Qnr) in ESBL-Producing Escherichia Coli and Klebsiella Spp. in Lomé, Togo’. Antimicrobial Resistance & Infection Control 8, no. 1 (18 June 2019): 104. https://doi.org/10.1186/s13756-019-0552-0.

11. Zhu, Ting, Tao Chen, Zhen Cao, Shan Zhong, Xin Wen, Jiandui Mi, Baohua Ma, et al. ‘Antibiotic Resistance Genes in Layer Farms and Their Correlation with Environmental Samples’. Poultry Science 100, no. 12 (1 December 2021): 101485. https://doi.org/10.1016/j.psj.2021.101485.