Plazmidna DNA pri zdravljenju tumorjev

Uvod

Za zdravljenje rakavih obolenj je bilo odkritih že mnogo različnih terapevtskih metod, a zaradi kompleksnosti in raznolikosti te bolezni velikokrat nobena izmed njih ne zadošča. Novejše raziskave se zato veliko bolj osredotočajo na molekularne specifičnosti rakavih celic, pri čemer izkoriščajo lastnosti posamezne vrste tumorjev. Zdravljenje z uporabo molekul DNA se je začelo z odkritjem prvega za tumorje specifičnega antigena. DNA v telo ponavadi vnesejo v obliki vektorjev, večinoma plazmidnih. Vektorji so v primerjavi z drugimi oblikami vnosa nukleinskih kislin bolj uporabni, saj je njihova produkcija precej preprosta, cenovno dostopna, plazmidi pa so dobro obstojni še dolgo časa po proizvodnji.

Oblikovanje plazmidov

Vsak plazmid mora nujno vsebovati vsaj eno območje, ki vsebuje regulatorno zaporedje in strukturni gen za protein, ki bo v celici izzval terapevtski učinek. DNA mora seveda pred tem priti v jedro, kjer poteče transkripcija, nato pa se mRNA prenese v citosol, kjer ga ribosomi prevedejo v protein. Da je vneseni plazmid čim bolj učinkovit, je pomembno, da je gostota nukleotidnih parov citozin-gvanin čim višja, saj se s tem prepiše večja količina mRNA. Poleg tega lahko dvoverižni zapis z veliko ne-metiliranimi CpG motivi (citozin-fosfat-gvanin) deluje imunostimulatorno s tem, da se veže na Toll-podoben receptor 9 (TLR9).1 TLR9 je receptor celic imunskega odziva in ima ključno vlogo pri prepoznavanju in sprožitvi odziva na bakterijsko in virusno DNA, ki vsebuje nemetilirane motive CpG. Te CpG motivi so pogosto del genoma patogenov. Ob vezavi CpG na TLR9 imunskih celic, začnejo celice izločati vnetne citokine. Ti aktivirajo prirojen imunski odziv, poleg tega pa še prilagojen imunski odziv, različne nekrotične faktorje in celice ubijalke.

Če želimo z uporabo ene vrste plazmida v celici izraziti dva ali več genov, jih lahko izrazimo neodvisno - vsakega s svojim promotorjem, kot multicistronski sistem - usklajeno izražanje genov pod vplivom istega promotorja, ali s fuzijskim proteinom - oba gena povezuje linkerska sekvenca.

Glede na lastnosti obravnavanega tumorskega tkiva, lahko gen, ki ga vstavimo v plazmid, zapisuje proapoptostski protein, citotoksičen peptid, bakterijski toksin ali encim, ki aktivira predzravilo. Predzdravila so učinkovine, ki se pogosto uporabljajo za zdravljenje. So neaktivne ali manj aktivne oblike zdravil, ki se po vstopu v telo pretvorijo v aktivno obliko in dobijo zdravilni učinek. Plazmid lahko vsebuje tudi za tumor specifičen promotor in zapis za majhno interfernčno RNA (siRNA). Gre za kratko dvoverižno RNA molekulo, ki se po vezavi z RISC (ang. RNA-induced silencing complex) razcepi, ena izmed verig pa se nato poveže s komplementarnim zaporedjem mRNA in onemogoči njeno prepisovanje v protein - jo utiša. Gen lahko zapisuje tudi neposredno nek citokin ali antigen, ki bo stimuliral imunske celice, predvsem limfocite in antigen predstavitvene celice (APC). Za delovanje so pomembni močni promotorji, saj je za izzvanje imunskega odziva potrebno visoko izražanje zaporedji, ki vsebujejo zapis za citokine oz. antigene. Plazmidi s tovrstnimi geni so uporabni predvsem zato, ker terapevtski odziv lahko sproži katerakoli celica, ki sprejme plazmid in ne nujno zgolj rakava. Kljub temu da plazmid sprejmejo katerekoli celice in se v njih sproži primarni odziv, bo sosledje dogodkov pripeljalo do napada imunskega sistema na rakave celice. Pomembni so tudi zapisi za monoklonska protitelesa, ki s svojo vezavo na rakave antigene onemogočajo signalne kaskade in širjenje rakavih celic.