Vloga plazmidov pri kvarjenju piva, ki ga povzročajo mlečne bakterije

Uvod

Pivo zaradi prisotnosti etanola, grenke hmeljne kisline, raztopljenega ogljikovega dioksida, zmanjšane koncentracije kisika in nizkega pH, predstavlja mikrobiološko stabilno pijačo. Zaradi svojih specifičnih karakteristik je primerno mikrookolje le za malo mikroorganizmov. Na njegovo pokvarljivost najbolj vplivata seva Lactobacillus in Pediococcus, saj sta tolerantni na hmelj, pritisk v prostoru ter nanju ne vpliva pomanjkanje hranil. Kisline v hmelju učinkujejo protibakterijsko na dva načina. Delujejo kot protonski translokatorji in razpršijo transmembranski pH gradient ter s tem zavirajo vnos hranil, kar vodi v celično stradanje. Drugi način protibakterijskega delovanja je transmembranska redoks reakcija, ki poteče ob prisotnosti Mn2+ in povzroči nastanek reaktivnih kisikovih zvrsti, ki so za celico škodljive. Toleranca mlečno kislinskih bakterij na hmelj je kompleksen večdelni sistem. Prejšnje študije so identificirale tri gene, ki delujejo kot posredniki odpornosti mlečno kislinskih bakterij na hmelj. HorA, horC in hitA. HorA zapisuje za protein, ki deluje kot ABC transporter in odstranjuje hmeljno kislino iz celice. HorC kodira za protein, ki deluje kot transporter zdravil, je odvisen od protonske gibalne sile ter prav tako odstranjuje hmeljno kislino iz celice. HitA pa naj bi deloval kot prenašalec Mn2+ iona in vzdrževatelj njegove homeostaze znotraj celice, kar vodi do zmanjšanja oksidativnega stresa. Vsi trije geni so bili določeni na plazmidih. S filogenetskega vidika vrste mlečno kislinskih bakterij, ki povzročajo kvarjenje piva niso tesno povezane. Na podlagi razdrobljene poravnave vseh zaporedij celotne plazmidne DNA, ki izhajajo iz danega seva, je bilo ugotovljeno, da je potencial kvarjenja piva bolj povezan s sestavo plazmidov in viri izolacije kot z vrsto. Z različnimi analizami je bila potrjena velika vloga najrazličnejših plazmidov za kvarjenje piva pri mlečnokislinskih bakterijah. Predpostavili so, da se različne funkcije (aktivnosti črpalke hmeljne kisline iz celice, znotrajcelično homeostazo Mn2+, modifikacijo celične ovojnice, proizvodnjo zunajceličnih polisaharidov, odziv na oksidativni stres in homeostaza pH) delijo med vrstami kot del mobilnih enot DNA, kot so plazmidi in skupaj dajejo mlečno kislinskim bakterijam zmožnost kvarjenja piva.

Geni kodirani na plazmidih uporabljeni kot diagnostični markerski geni (DMGs)

horA

Sprva so verjeli, da se zapisi za gene za toleranco proti antimikrobnemu delovanju hmeljnih kislin nahajajo na kromosomski DNA. Prvi plazmid, ki je to teorijo postavil pod vprašaj je bil pRH45, saj so pri bakteriji L. Brevis opazili padec tolerance do hmeljnih kislin v odsotnosti tega gena, ponovni vnos plazmida v celice pa je bakterijam omogočil ponovno preživetje in razmnoževanje. pRH45 nosi zapis za skupek genov (ang: gene cluster) horA in 5 odprtih bralnih okvirjev (ORFs). horA je ohranjen v mnogih sevih mlečnoskislinskih bakterij, ki so odgovorne za kvarjenje piva in nosi zapis za protein, ki je pokazal 53% ujemanje s LmrA proteinom družine ABC. Ta prenaša snovi, ki so za celico škodljive v zunajcelični prostor. Njegova prisotnost in ohranjenost v različnih sevih mlečnokislinskih bakterij kaže na to, da je prišlo do horizontalnega prenosa gena med mikroorganizmi. Pri organizmu L. Brevis eden izmed odprtih bralnih okvirjev, ORFB12, nosi zapis za encim transpozazo, za katero znanstvenik verjamejo, da je odgovorna pri transpoziciji s »cut and paste« mehanizmom. Zaradi prisotnosti horA v večini sevov mlečnoskislinskih bakterij, ki so odgovorne za kvarjenje piva so sumili, da gen lahko uporabijo kot diagnostični markerski gen (DMG). Dodatne raziskave pa so pokazale, da je prišlo do velikega števia lažno pozitivnih rezultatov; tudi sevi, ki niso odgovorni za kvarjenje piva so vsebovali gen. Znanstveniki so na koncu porišli do zaključka, da je horA odgovoren za toleranco na razne stresne faktorje in je torej le-ta neprimeren DMG.

horC

Gen horC so najprej identificirali v plazmidu s 23,4 kb pari iz organizma L. Brevis, ko so del plazmida z genom izločili iz celic in opazili padec v toleranci bakterije proti hmeljnim kislinam. HorC, produkt horC je PMF-odvisen protein, ki je prav tako, kakor HorA odgovoren za transport hmeljne kisline iz celice. V bližini horC je bil vedno prisoten tudi gen horB, za katerega raziskavekažejo, da deluje kot transkripcijski represor horC v mediju brez hmeljnih kislin. Skupek genov je poleg horB/horC vseboval 11 ORF, ki kodirajo razne encime, med katerimi so pomembni encimi za modifikacijo in odebelitev celične stene. Pri genu horC je bilo število lažno pozitivnih rezultatov pri uporabi gena kot DMG znatno nižje kot pri horA. Iz raziskav pa je bilo razvidno, da celice, ki so nosile zapis samo za ta gen niso uspešno tolerirale neugodnega okolja. Za uspešno preživetje celica potrebuje tudi gen za biosintezo maščobnih kislin (FAS), ki v sodelovanju s horC uspešno varuje celico pred hmeljnimi kislinami.

hitA

Gen hitA nosi zapis za protein iz družine Nramp (ang: natural resistance-associated macrophage family), ki je odgovoren za prenos dvovalentnih kovinskih kationov v raznih prokariontskih in evkariontskih organizmih. Ob prisotnosti hmeljnih kislin se tvori kompleks z dvovalentnimi Mn2+ ioni. Protein regulira prenos dvovalentnih ionov in skrbi za normalni potek celičnih aktivnosti, ki so od le-teh odvisne, kot npr. minimizacija oksidativnega stresa. V primerjavi z genoma horA in horC je gen hitA pokazal manjšo učinkovitost pri uporabi kot DMG.

Prisotnost horA, horC in hitA je kljub prisotnosti v večini mlečnokislinskih bakterij, ki so odgovorne za kvarjenje piva, velikokrat nekonsistentna in ni vedno primerna za uporabo kot DMG. Zaradi tega znanstveniki iščejo nove plazmidne gene, ki bi bili za to primernejši.

Eden izmed teh je gtf D15 , ki nosi zapis za putativno glikotransferazo, ki sodeluje pri glikozilaciji celične stene in drugi produkt GTF D15 , ki se veže na celično ovojnico in zaščiti celico pred hmelnjimi kislinami. gtf D15 so večkrat identificirali v horA, kar je prvič pokazalo, da se lahko več genov za varovanje celice pred delovanjem hmeljnih kislin lahko nahaja v istem skupku genov. Raziskave so pokazale, da gtf D15 deluje pri višjih temperaturah (30 °C) medtem, ko je horA najbolj aktiven pri nižjih temperaturah (15°C).

Alfa-acetolaktatni operon

Pred kratkim je bilo ugotovljeno, da je sposobnost proizvajanja diacetila iz piruvata, ki jo ima P. Damnosum plazmidno kodirana lastnost, zaradi prisotnosti alfa-acetolaktatnega operona. Končni produkt je najpogosteje laktat, katerega izločanje zmanjša pH vrednost okoli celic. Redkeje je končni produkt diacetil, ki omogoči hitrejšo rast bakterij v pivu.

Glikoziltransferazni gen

Zaradi prisotnosti gena glikoziltransferaze-2 lahko poteka sinteza beta-(1,3)-glukana, ki je sestavni del eksopolisaharidov. Gen vsebujejo sevi mlečnokislinskih bakterij, zato lahko sintetizirajo eksopolisaharide, ki dajejo pivu značilno rjavo barvo. Geni iz družine glikoziltransferaz-2 se prenašajo horizontalno, kar dokazuje identičnost nukleotidnih sekvenc prisotna v različnih sevih mlečnokislinskih bakterij. Geni sevom omogočajo lažje preživetje v kislem okolju, višjim temperaturam in jim dajejo odpornost na razkužila, zaradi česar v pivovarstvu predstavljajo velik problem.

Uporaba DMG-jev pri mikrobioloških testih kontrole kakovosti

Izbira primernih DMG-jev za mikrobiološke teste kontrole kakovosti

Identifikacija mikrookragnizmov med proizvodnjo piva in v končnem izdelku je ključna za preprečevanje težav s kakovostjo piva. Vse bolj popularne postajajo metode identifikacije vrst s PCR, vendar problem predstavljajo nove vrste mlečnokislinskih bakterij, ki jih standardni PCR testi, ki so specifični za posamezno vrsto, ne pokrijejo. Poleg tega pa lahko znotraj iste vrste med sevi opazimo razlike v zmožnosti kvarjenja piva. Zato je priporočjivo nemesto testov, ki so specifični za posamezno vrsto, uporabiti teste na osnovi DMG-jev, ki so prisotni v številnih vrstah mlečnokislinskih bakterij z zmožnostjo kvarjenja piva. Najbolj razširjena DMG-ja med vrstami mlečnokislinskih bakterij z zmožnostjo kvarjenja piva sta horA in horC. Poleg teh dveh so pogosto prisotni še hitA, gtfD15/ORFB5 in regija ORF4–6. Zato lahko te DMG-je, ki se pogosto pojavljajo pri vrstah mlečnokislinskih bakterij z zmožnostjo kvarjenja piva, uporabimo za identifikacijo novih še ne poznanih vrst z zmožnostjo kvarjenja piva. Pri izvajanju testov z DMG-ji moramo biti previdni, saj uporaba večih DMG-jev za identifikacijo lahko privede do več lažno pozitivnih testov, nasprotno pa velja za lažno pozitivne teste. Po številnih poskusih so ugotovili, da imajo testi, pri katerih so uporabili horC malo lažno pozitivnih rezultatov, zato je za testiranje praktično uporabiti horC v kombinacij z enim ali več drugih DMG-jev.

Nestabilnost DMG-jev

Večina trenutno poznanih DMG-jev je zapisanih na plazmidih in nekaj od teh je nestabilnih. Ohranjanje plazmidov je energijsko breme za bakterijo in zahteva selekcijski pritisk. Plazmidi morajo imeti ključno vlogo pri zagotavljanju preživetja bakterij v življenjskem okolju, da se ohranjajo. Izgubo DMG-ja horA so opazili pri L. paracollinoides JCM 11969T med precepljanjem v hranilnem gojišču MRS juha, ki je obogateno selektivno gojišče za mlečnokislinske bakterije, ker bakterije niso bile izpostavljene selekcijskemu pritisku. Dodatek podinhibitorne količine grenkih hmeljnih kislin, je izgubo horA upočasnila, ni pa je preprečila. Opažena je bila tudi izguba horC med precepljanjem v hranilnem gojišču. Iz tega lahko sklepamo, da so DMG-ji na palzmidih nestabilni med precepljanjem v hranilnem gojišču, ki ne zagotavlja selekcijskega pritiska za bakterije. Iz kartiranja pretoka genov tolerance na hmelj v pivovarnah so ugotovili, da selekcijski pritisk za pridobitev in ohranjanje tolerance na hmelj obstaja samo ob prisotnosti hmeljeva piva. Pokazali so, da se horA in horC stabilno ohranjata med precepljanjem različnih sevov z zmožnostjo kvarnjenja piva v razplinjenem pivu tipa lager. To so opazili tudi pri L. paracollinoides JCM 11969, pri katerem je bila opažena izguba horA med precepljanjem v hranilnem gojišču. Poleg tega so opazili, da je veliko sevov mlečnokislinskih bakterij z zmožnostjo kvarjenja piva, pri katerih najprej niso zaznali DMG-jev, po inkubaciji v pivu pridobilo horA, horC in hitA. To nam pove, da je majhna populacija celic z DMG-ji lahko rastla v pivu, medtem ko celice brez DMG-jev niso preživele. Zaradi nestabilnosti DMG-jev je priporočljivo, da se sevi mlečnokislinskih bakterij z zmožnostjo kvarjenja piva, ki so bili izolirani iz pivovarnic ali zapakiranega piva, rutinsko precepljajo v pivu, da so izpostavljeni selekcijskim pritiskom, ki so potrebni za ohranjanje DMG-jev, ki omogočajo zmožnost kvarjenja piva. Da lahko z mikrobiološkimi testi kakovosti pridobimo reprezentativne rezultate, je ključno, da kultura ostane genetsko homogena, kot je bila ob primarni izolaciji.

Zaključek

Toleranca za hmelj in zmožnost kvarjenja piva sevov mlečnokislinskih bakterij se je razvila v dolgi zgodovini pivovarjenja. Večina DMG-jev, ki omogočajo zmožnosti kvarjenja piva, je bilo najdenih na plazmidih. Teste na osnivi DMG-jev lahko uporabimo za identifikacijo še ne pozanih mlečnokislinskih bakterij z zmožnostjo kvarjenja piva. Še vedno pa obstajajo sevi mlečnokislinskih bakterij, ki nimajo trenutno poznaih DMG-jev, zato so nadaljne raziskave na tem področju ključnega pomena za zagotavljanje kakovosti piva.

Viri

1. Suzuki, Koji, et al. ‘Role of Plasmids in Beer Spoilage Lactic Acid Bacteria: A Review’. Journal of the American Society of Brewing Chemists, vol. 79, no. 1, Jan. 2021, pp. 1–16. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1080/03610470.2020.1843899.

2. Yin, Hua, et al. ‘A Novel horA Genetic Mediated RCA Detection of Beer Spoilage Lactobacillus’. Microbial Pathogenesis, vol. 114, Jan. 2018, pp. 311–14. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1016/j.micpath.2017.11.064.