Z dvojno svetlobo nadzirani kokulturni sistem omogoča uravnavanje sestave populacije

Izhodiščni članek: A dual light-controlled co-culture system enables the regulation of population composition

UVOD

Uporaba kokultur

Dandanes je pogosta uporaba mikroorganizmov za biosintezo produktov, kot so farmacevtski izdelki, biogoriva, biokemikalije in druge visoko vredne spojine [1]. Da bi zadostili zahtevam trga se je razvila modularna tehnologija kokultur, katere namen je razdeliti ciljno kompleksno pot v ločene module, ki se nahajajo v različnih sevih [2].

Raziskovalci tako želijo vzpostaviti vsestranske sisteme kokultur, saj ti lahko premagajo ovire, ki jih monokulturni sistemi oziroma konvencionalne metode pogosto ne morejo [3].

Regulacija populacijskih razmerij – optogenetika

Za optimiziranje učinkovitosti bioprodukcije je dinamična regulacija populacijskih razmerij ključnega pomena. Trenutni pristopi, kot so prilagajanje začetnega inokulacijskega razmerja in po potrebi dodajanje sevov med tekom celotnega procesa ter uporaba kemičnih induktorjev, ne omogočajo odzivnosti na spreminjajoče razmere znotraj sistema in aktivnega spreminjanja sestave sistema [3].

Raziskovalci zato razvijajo optogenetske sisteme z visoko univerzalnostjo in prilagodljivostjo za širok nabor uporabe. Optogenetika je tehnika, ki omogoča regulacijo celične aktivnosti preko nadzora nad prepisovanjem, izražanjem in urejanjem genov z uporabo svetlobe določene valovne dolžine, pri čemer se uporabljajo svetlobni viri v spektru od ultravijolične pa vse do daljne rdeče svetlobe [3,4]. To je neinvazivna, hitro reverzibilna, minimalno toksična tehnika z visoko prostorsko-časovno specifičnostjo. Tak pristop ima velik potencial za dinamični nadzor nad razmerjem populacij v kokulturah [3].

OPTOGENETSKI SISTEM

Raziskovalci so oblikovali z dvojno svetlobo nadzirani kokulturni sistem, ki predstavlja indukcijski modul. Dodali so dva ortogonalna sistema za zaznavanje gostote, ki delujeta kot komunikacijski modul ter sistem toksin-antitoksin, ki deluje kot efektorski modul [3].

Z dvojno svetlobo nadzirani kokulturni sistem – indukcijski modul

Več naravnih celic izraža proteine, ki se odzivajo na svetlobo različne valovne dolžine, kot je rodopsin pri človeku. V članku so uporabili dva dvokomponentna sistema, ki sta sestavljena iz senzorične histidin kinaze in regulatorja odziva. Njuno aktivnost regulirata fosforilacija in defosforilacija, ki sta posledica osvetlitve s svetlobo določene valovne dolžine [5].

Prvi sistem sestavljata CcaS in CcasR. CcaS je cianobakteriokrom, ki deluje kot fotoreceptor. Njegova značilnost je reverzibilna fotokonverzija med dvema različnima oblikama. Vsaka absorbira svetlobo druge valovne dolžine. Ob osvetlitvi s svetlobo valovne dolžine 520 nm (zelena barva) pride do konformacijskih sprememb, ki vodijo do avtofosforilacije proteina. Tej sledi prenos fosforilne skupina na CcaR, ki je odzivni regulator, katerega aktivnost regulira fosforilacija [6]. CcaR se veže na mesto za aktivator, ki je del promotorja PcpcG2. Celoten proces je reverzibilen s svetlobo valovne dolžine 620 nm (rdeča barva), pri čemer se CcaS defosforilira [3].

Drugi sistem sestavljata YF1 in FixJ. V temi je YF1 senzorična histidin kinaza, ki fosforilira FixJ. Osvetlitev s svetlobo valovne dolžine 460 nm (modra barva) sproži konformacijske spremembe, ki zmanjšajo kinazno aktivnost, povečajo pa fosfatazno. Tako FixJ ni fosforiliran, posledično se ne veže na mesto za aktivator, ki je del promotorja PFixK2 [7]. Raziskovalci pa so želeli obrniti funkcijo teme in modre svetlobe, zato so dodali represor PhlF in tako ustvarili negacijo (NE). V temi se FixJ veže na promotor PFixK2 in s tem aktivira izražanje represorja PhlF, ki se veže na operator promotorja PPhlF. Ta regulira izražanje tarčnega proteina in ga v tem primeru inhibira. Pri modri svetlobi sistem YF1-FixJ ni aktiven, represor se ne izraža in ne inhibira tarčnega proteina. Tako se ta izraža le ob osvetljevanju z modro svetlobo [5].

Ortogonalna senzorja gostote celic – komunikacijski modul

Za zaznavanje gostote celic in komunikacijo med sevoma so uporabili dva ortogonalna sistema in sicer tra* in las sistem. Tra* sistem je optimiziran tra sistem. Sestavljajo ga regulator TraR(W), promotor Ptra* in homoserin lakton (HSL) sintaza EsaI, ki sintetizira 3OC6HSL (N-(3-oksoheksanol)-homoserin lakton). Las sistem sestavljajo regulator LasR, promotor Plas in HSL sintaza LasI, ki sintetizira 3OC12HSL (N-(3-oksododekanol)-homoserin lakton) [3].

Toksin-antitoksin sistem – efektorski modul

Efektorski modul predstavlja sistem toksin-antitoksin. Uporabili so operon ccd, ki kodira ccdA in ccdB. CcdB je toksin, ki inhibira DNA girazo, kar vodi v celično smrt. CcdA pa je antitoksin, ki inhibira ccdB in s tem varuje celico pred njegovimi toksičnimi učinki [3].

Delovanje kokulture

Za pripravo dveh sevov LG in LR, ki vsebujeta naštete module, so uporabili E. coli seva TOP10-GFP in TOP10-RFP, ki imata v genom integriran gen za GFP oziroma RFP. Tako so ju lahko identificirali na podlagi fluorescence. Sev TOP10-GFP so transformirali z vektorjema, ki vsebujeta zapis za proteine sistema CcaS/CcaR, las sistema (LasI in lasR), ccdB pod kontrolo promotorja Plas, regulator TraR(W) in ccdA pod kontrolo promotorja Ptra*. Tako so pripravili sev LG. Na enak način so pripravili sev LR, le da ta vsebuje zapis za proteine YF1-FixJ-PhlF sistema, tra* sistema (EsaI in traR(W)), ccdB pod kontrolo promotorja Ptra*, regulator lasR in ccdA pod kontrolo promotorja Plas [3].

Zelena oziroma modra svetloba vklopita – aktivirata indukcijski modul, ki omogoča izražanje HSL sintaze v sevu LG oziroma LR. Sintetiziran homoserin lakton se skupaj s konstitutivno izraženim regulatorjem veže na mesto za aktivator in s tem omogoči izražanje ccdB. Tako svetloba sproži negativno povratno zanko preko cis-delujoče HSL aktivacije ekspresije toksina. Homoserin lakton pa se z difuzijo prenese tudi v drug sev, kjer s trans-delujočo HSL aktivacijo poveča izražanje ccdA in tako deluje pozitivno na rast drugega seva [3].

EKSPERIMENTALNA POTRDITEV FUNKCIONALNOSTI KOKULTURNEGA SISTEMA

Karakterizacija posameznega seva

Medsebojni vpliv oziroma sporazumevanje med dvema indukcijskima moduloma lahko prepreči natančno regulacijo sistemov, kar lahko vodi do nepričakovanih rezultatov in izgube delovanja vezja. Zato so raziskovalci s prvim poskusom preverili učinkovitost optogenetske indukcije in morebitnih prekrivanj pri različnih valovnih dolžinah. Pripravili so dva verifikacijska seva T-LG in T-LR, ki sta imela namesto ccdB, vstavljen zapis za reporterski protein GFP. Celice so izpostavili svetlobi različne valovne dolžine in temi, da bi ocenili njihove odzive. Sev T-LG je pokazal močno aktivnost pri obsevanju z zeleno svetlobo, sev T-LR pa pri obsevanju z modro svetlobo in šibko aktivacijo, ki je posledica medsebojnega vpliva, pri zeleni svetlobi. Raziskovalci so predvidevali, da ta nivo aktivacije ne bo porušil funkcionalnosti sistema. Da so dosegli sočasno izklopljeno - neaktivno stanje obeh sevov, so se odločili za uporabo rdeče svetlobe, saj ta manj vpliva na T-LR kot tema na T-LG. Tako so uvedli enoten način nadziranja sevov s svetlobo [3].

Nato so preverili, kako svetloba vpliva na gostoto celic seva LG in LR, torej delovanje efektorskega modula. Obsvetljevali so jih 12 h z rdečo svetlobo, nato pa 12 h z zeleno oziroma modro svetlobo. Rezultati merjenja fluorescence GFP in RFP so pokazali, da je zelena svetloba uspešno aktivirala CcaS/CcaR sistem, ki je preko las sistema vodil do izražanja ccdB in inhibicije rasti seva LG. Modra svetloba pa je inhibirala rast seva LR, torej je prišlo do aktivacije YF1-FixJ-PhlF sistema, ki je preko tra* sistema, vodil do izražanja ccdB [3].

Karakterizacija kokulturnega sistema

Za karakterizacijo z dvojno svetlobo nadziranega kokulturnega sistema so pripravili kokulturo v razmerju 1 : 1 (LG : LR). Celice so preko noči gojili pri rdeči svetlobi, nato pa spremljali gostoto celic posameznega seva z merjenjem fluorescence pri izpostavitvi kokulture zeleni oziroma modri svetlobi. Zelena svetloba je izrazito inhibirala rast seva LG, medtem ko je rast seva LR ostala nespremenjena. Modra svetloba pa je povzročila ravno obraten odgovor. Bolj natančna analiza s pretočno citometrijo in konfokalno mikroskopijo je pokazala, da se je po 12 h obsevanja z zeleno svetlobo ravnotežje premaknilo na 1 : 2,9 (LG = 24,1 % in LR = 69,2 %), po 12 h obsevanja z modro svetlobo pa na 2,8 : 1 (LG = 69,2 % in LR = 24,9 %). Ti rezultati potrjujejo delovanje komunikacijskega modula in da zasnovan sistem kokulture deluje kot predvideno [3].

Glavni prednosti uporabe takega sistema sta dinamičnost in reverzibilnost. Da bi to potrdili, so naredili naslednja dva poskusa. Z izmenjavanjem zelene in modre svetlobe, so dokazali, da je sistem dinamičen, saj so rezultati pokazali, da se z zamenjavo svetlobe zamenja tudi prevladujoč sev. Samo reverzibilnost sistema pa so preverili z izmenjavanjem rdeče in zelene svetlobe, torej je prihajalo do preklopa med izklopljenim in vklopljenim stanjem. Pri osvetljevanju z zeleno svetlobo je prišlo so aktivacije vklopljenega stanja in zmanjšal se je delež seva LG. Nato so zamenjali barvo svetlobe in razmerje se ni bistveno spremenilo. Ko pa so kokulturo ponovno izpostavili zeleni svetlobi, se je delež seva LG ponovno zmanjšal [3].

Stabilno razmerje populacij

Z zadnjim poskusom so raziskovalci preučili sposobnost sistema za vzdrževanje stabilnega razmerja med populacijama s hkratno indukcijo z zeleno in modro svetlobo. Seva v vklopljenem stanju drug drugega ščitita pred celično smrtjo in tako tvorita simbiotski odnos, ki ima potencial vzdrževati stabilnost sistema. Rezultati so pokazali, da se je razmerje populacij stabiliziralo po 12 h sočasne uporabe zelene in modre svetlobe ter ostalo stabilno do 48 h [3].

ZAKLJUČEK

Raziskovalci so torej uspešno oblikovali in vzpostavili z dvojno svetlobo nadzirani kokulturni sistem. Ta omogoča učinkovito regulacijo sestave populacij z uporabo optogenetskih stikal, kar je neinvazivno, časovno specifično in malo toksično. Te lastnosti odpirajo nove možnosti aplikacij predvsem v biotehnoloških področjih, kot je metabolno inženirstvo. Sistem omogoča tako dinamično kot reverzibilno uravnavanje razmerja populacij. Poleg tega so dokazali, da je mogoče doseči stabilno razmerje s hkratno indukcijo z dvema valovnima dolžinama svetlobe. Nadaljnje izboljšave, kot je modulacija intenzivnosti svetlobe, pa bi lahko omogočile še natančnejši nadzor nad razmerji sevov [3].

LITERATURA

[1] Wong M, Badri A, Gasparis C, Belfort G, Koffas M. Modular optimization in metabolic engineering. Crit Rev Biochem Mol Biol 2021;56:587–602. https://doi.org/10.1080/10409238.2021.1937928,

[2] Zhao S, Li F, Yang F, Ma Q, Liu L, Huang Z, et al. Microbial production of valuable chemicals by modular co-culture strategy. World J Microbiol Biotechnol 2022;39:6. https://doi.org/10.1007/s11274-022-03447-6,

[3] Jiang W, Guo Y, Liang X, Zhang Y, Kang J, Jin Z, et al. A dual light-controlled co-culture system enables the regulation of population composition. Synth Syst Biotechnol 2025;10:574–82. https://doi.org/10.1016/j.synbio.2025.02.012,

[4] Optogenetics - an overview | ScienceDirect Topics. n.d. URL: https://www.sciencedirect.com/topics/neuroscience/optogenetics (Accessed 4 May 2025), [5] Wang S, Luo Y, Jiang W, Li X, Qi Q, Liang Q. Development of Optogenetic Dual-Switch System for Rewiring Metabolic Flux for Polyhydroxybutyrate Production. Molecules 2022;27:617. https://doi.org/10.3390/molecules27030617,

[6] Hirose Y, Shimada T, Narikawa R, Katayama M, Ikeuchi M. Cyanobacteriochrome CcaS is the green light receptor that induces the expression of phycobilisome linker protein. Proc Natl Acad Sci U S A 2008;105:9528–33. https://doi.org/10.1073/pnas.0801826105,

[7] Möglich A, Ayers RA, Moffat K. Design and Signaling Mechanism of Light-Regulated Histidine Kinases. J Mol Biol 2009;385:1433–44. https://doi.org/10.1016/j.jmb.2008.12.017.