Izgradnja metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola

Izhodiščni članek: Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of threonine from ethylene glycol

Uvod

9 od 20 proteinogenih aminokislin je esencialnih, saj jih ljudje in živali ne moremo sintetizirati sami, ampak jih moramo zaužiti s hrano. Aminokisline so pomembne tudi kot ojačevalci okusa v prehrambni industriji ter prekurzorji v farmacevtski in kozmetični. Večina proteinogenih aminokislin se industrijsko proizvaja s fermentacijo iz sladkorjev z izoliranimi encimi [1]. Zaradi velike potrebe po sladkorjih pa to v prihodnosti morda ne bo najboljši vir za proizvodnjo aminokislin. Razvoj alternativnih poti sinteze vključuje dve glavni surovini prihodnosti; CO2 (iz metanola, etilen glikola (EG) ali etanola) in plastične odpadke (npr. EG) [2].

Predhodno so znanstveniki že razvili od treoze odvisno sintezno pot asimilacije glikolaldehida (STEGA) za proizvodnjo 2,4-dihidroksibutirata, prekurzorja Met. Med sintezo so opazili, da v manjši meri nastane tudi stranski produkt L-treonin (L-Thr) [3].

L-Thr spada v družino aminokislin, ki se sintatizirajo iz aspartata. Njegova biosinteza poteka prek β-aspartil-fosfatne poti. Na tej poti se L-aspartat, ki nastane iz oksaloacetata v Krebsovem ciklu, pretvori v homoserin. Ta se nato s homoserin kinazo in treonin sintazo (encima ThrB in ThrC) pretvori v L-Thr. Domnevali so, da se predhodno razvita STEGA povezuje s potjo biosinteze L-Thr prek transaminacije, v kateri iz intermediata 2-okso-4-hidroksibutirata (OHB) nastane homoserin [2].

Z namenom proizvodnje L-Thr so raziskovalci želeli prilagoditi STEGA tako, da bi kot glavni produkt te poti nastajal L-Thr. Ker je mogoče izhodiščni substrat glikolaldehid (GA) biokemijsko pridobiti iz metanola ali EG to predstavlja inovativno in trajnostno alternativno obstoječemu pridobivanju L-Thr [2].

Načrtovanje in metode za izgradnjo metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola

Za izražanje potrebnih encimov so konstrukte vstavili v plazmide pEXT in plazmide serije pZ z restrikcijskim kloniranjem, kasneje so dodatno uporabili tudi plazmid pACT3. Plazmide so vnesli v seve E. coli z delecijami ključnih genov v poti asimilacije L-Thr iz GA oziroma EG. Delecije so uvedli s transdukcijo s fagi, ki so imeli izbite želene gene. Selekcijo so izvedli na ploščah s kanamicinom in potrdili s PCR na osnovi kolonije. Dodatne spremembe, kot so zamenjave naravnih promotorjev in vključitev selekcijskih markerjev (odpornost na kloramfenikol), so izvedli s Flp/FRT rekombinacijo. Pravilno vstavitev selekcijskega markerja so preverili s PCR z mestno specifičnimi začetnimi oligonukelotidi, zaporedje promotorja pa s sekvenciranjem po Sangerju [2].

Rezulatti in razprava

Testiranje delovanja od treoze odvisne sintezne poti asimilacije glikolaldehida za proizvodnjo L-treonina

Za preverjanje možnosti sinteze L-Thr preko STEGA so razvili avksotrofni sev E. coli TW476, ki ne raste brez eksogenega Thr. Ta ne izraža encimov za razgradnjo GA in prav tako nima aktivne aspartat-semialdehid dehidrogenaze, ki sodeluje pri pretvorbi D-glukoze v homoserin, prekurzor L-Thr. Z dodajanjem posameznih intermediatov STEGA (D-treonat, D-treoza, GA) in vnosom ustreznih zapisov za encime so testirali, ali lahko bakterije zrastejo. Celice so gojili pri 37 °C na rotacijskem stresalniku in spektrofotometrično spremljali njihovo rast [2].

Po potrditvi, da sev TW476 ne raste v prisotnosti D-treonata, so v sev zaporedno vnesli encimske aktivnosti, potrebne za pretvorbo D-treonata v L-homoserin. Ta spojina se nato s fosforilacijo in dehidracijo znotrajcelično pretvori v L-Thr. Reakciji katalizirata endogena encima ThrB in ThrC, ki se izražata iz operona thrABC . Za vzpostavitev rasti, odvisne od D-treonata, so tako ustvarili sev TW548, ki izraža D-treonat dehidratazo iz bakterije rodu Herbaspirillum huttiense (Hh.araD). Encim namreč pretvarja D-treonat v OHB, prekurzor homoserina. Za boljši privzem treonata iz okolja so kasneje v sev vnesli tudi gen za transporter treonata. Za izboljšanje tvorbe homoserina iz OHB pa so prekomerno izrazili gen za endogeno L-aspartat transaminazo (AspC) (sev TW504). Uspešna asimilacija GA je bila dosežena s sočasnim izražanjem D-treoza aldolaze, D-treoza dehidrogenaze in D-treono-1,4-laktonaze (sev TW506). Ker so opazili zaviranje rasti pri povišani koncentraciji GA, so nadaljnja testiranja izvajali v mediju z 2 mM GA [2].

Biosinteza L-treonina iz glikolaldehida

V sevu TW64, ki je izražal vse potrebne encime za celotno STEGA, transporter za izvoz Thr in konstitutivno izražene gene operona thrABC , so z analizo supernatantov dokazali sintezo L-Thr iz GA. Izražanje genov so sprožili z dodatkom 0,5 mM IPTG ter po 24 h bakterijske kulture filtrirali in analizirali z masno spektometrijo sklopljeno s tekočinsko kromatografijo (LC/MS). Pri tem so v gojišču zaznali 0,53 mM L-Thr. Za določitev vira ogljika v nastalem L-Thr so uporabili 13C-označen GA in z LC/MS analizo preverili stopnjo izotopske označenosti v različnih metabolitih. L-Thr in homoserin (njegov neposredni predhodnik) sta bila visoko označena, medtem ko Asp in Lys nista vsebovala označenega ogljika. To potrjuje, da 13C-označena homoserin in L-Thr nista bila sintetizirana po naravni poti iz Asp, temveč izključno prek sintezne poti iz OHB [2].

Da bi preprečili ponovni vnos produkta iz gojišča, so iz sevov, ki L-Thr proizvajajo, zaporedoma izbili gen za transporter L-Thr ter ključne gene, povezane z metabolizmom L-Thr v Gly in Ile. Da bi preprečili sintezo Met iz homoserina so odstranili tudi aktivnost homoserin O-sukciniltransferaze. Tako konstruirani sev TW2214 so nato opremili s celotno sintezno potjo asimilacije L-Thr iz GA, da so dobili sev TW2219, ki je bil sposoben proizvesti do 0,79 mM L-Thr brez opazne ponovne uporabe produkta [2].

Po dodatku označenega substrata se je začela kopičiti treoza, intermediat pri pretvorbi GA v L-Thr. Treoza je bila glavni produkt poti pri vseh časovnih točkah, medtem ko sta se treonat in OHB kopičila v precej nižjih koncentracijah. To nakazuje na ozko grlo pri encimih, ki pretvarjajo treozo. Skupno so 43 % ogljika iz GA zaznali v zunajceličnih metabolitih, kar pomeni, da se je pomemben delež ogljika preusmeril stran od ciljne poti. Na podlagi zasledovanja 13C so sklepali, da se je del GA preusmeril v sintezo D-arabinoze-5-fosfata, ki nato vstopa v pentoza-fosfatno pot in sodeluje pri sintezi gradnikov celične stene [2].

Biosinteza D-treonata iz etilen glikola

Ko so zadovoljili poti sinteze L-Thr iz GA, so se osredotočili na začetni del, torej pretvorbo EG v D-treonat.

Za oksidacijo EG so uporabili od NAD+ odvisno alkohol dehidrogenazo iz bakterije Gluconobacter oxydans. Ker pa je ta reakcija termodinamsko neugodna, so dodatno izrazili tudi NADH oksidazo iz Streptococcus pneumoniae , ki iz NADH in kisika tvori NAD⁺ in vodo ter s tem poganja reakcijo naprej. Potrebne gene so vnesli v plazmid pACT3 pod nadzorom promotorja pTAC ter z njim tranformirali sev TW2214. Dobljeni sev so poimenovali TW2295. Ekspresijo so v eksponentni fazi rasti inducirali z 0,5 mM IPTG. Tako pripravljen sev TW2295 je proizvedel 1,42 mM treonata. Ko so znižali koncentracijo IPTG na 0,01 mM, se je proizvodnja treonata močno izboljšala – na 6,43 mM, zato so v nadaljevanju uporabljali to koncentracijo [2].

Ker je imela uporabljena D-treoza dehidrogenaza iz bakterije Paraburkholderia caryophylli (Pc.TadH) nizko afiniteto do nenaravnih substratov so se osredotočili na iskanje novih encimov, ki ne bi povzročili kopičenja treoze. S testiranjem raznih homologov so z uporabo dehidrogenaze iz bakterije Xanthomonas campestris v 48 urah izboljšali proizvodnjo treonata za 69 % v primerjavi s Pc.TadH [2].

Biosinteza L-treonina in izkoriščanje etilen glikola

Sledilo je neposredno dokazovanje sinteze L-Thr iz EG z izražanjem vseh potrebnih encimov v enem samem sevu. Uporabili so sveže rekonstituirane celice, inducirane z IPTG, in jih inkubirali v mediju s 320 mM EG ter bodisi 10 g/L glukoze bodisi glukoznim FeedBeads® za nadzorovano sproščanje glukoze v gojišče. Spremljali so rast celic, porabo substratov in nastanek produktov. Ugotovili so, da so celice uspešno pretvarjale EG v intermediate STEGA ter končni produkt L-Thr. Povišano sintezo (226 μM L-Thr po 48 h gojenja) so dosegli s sevom TW2494, ki izraža transaminazo AspC in dehidratazo Hh.araD pod srednje močnim promotorjem PJ23107. V ločenih poskusih z nedelečimi-se celicami so prav tako zaznali sintezo L-Thr, kar pomeni, da pot ne zahteva aktivne delitve celic in lahko deluje kot biokatalitska osnova [2].

Ker je bil D-treonat glavni produkt poti, so domnevali, da je aktivnost Hh.araD, ki je odvisna od [2Fe-2S], lahko omejena zaradi pomanjkanja Fe-S skupkov. Da bi sprostili izražanje operona ISC, odgovornega za sintezo Fe-S skupkov, so izbili gen za regulator operona (IscR). Novi sev TW2505 je dosegel 2,6-krat višjo koncentracijo L-Thr [2].

Čeprav se GA ni bistveno kopičil, pot vključuje vmesne reaktivne produkte, ki lahko tvorijo reaktivne kisikove zvrsti, ki vplivajo na encime, kot je D-treonat dehidrataza. Zato so preverili vpliv dodatne superoksid dismutaze in katalaze na biosintezo L-Thr. Izražanje katalaze KatG je po 48 h gojenja omogočilo sintezo 6,53 mM L-Thr in boljšo porabo EG (67,72 mM; 22 % začetnega EG). Izražanje superoksid dismutaze SodB pa je zmanjšalo kopičenje treonata, vendar ni izboljšalo sinteze L-Thr [2].

Zaključek

V tej študiji so razširili spekter produktov STEGA in omogočili sintezo L-Thr iz GA in EG. Računalniška analiza je pokazala, da ima STEGA pot potencialno višje izkoristke in nižjo porabo kisika kot naravne in druge sintezne poti za sintezo L-Thr iz EG [2].

Nadaljnje encimsko inženirstvo ter uporaba evolucijskih pristopov bi lahko dodatno izboljšala aktivnost encimov in izkoristek sintezne poti. Kljub potrebnim optimizacijam gre za obetaven način pretvorbe trajnostnega ogljikovega vira EG v L-Thr [2].

VIri in literatura

[1] W. Leuchtenberger, K. Huthmacher, K. Drauz: Biotechnological production of amino acids and derivatives: current status and prospects. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005, 69, 1–8.

[2] C. J. R. Frazão, N. Wagner, T. A. S. Nguyen, T. Walther: Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of threonine from ethylene glycol. Metab. Eng. 2025, 88, 50–62.

[3] C. J. R. Frazão, N. Wagner, K. Rabe, T. Walther: Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of 2,4-dihydroxybutyric acid from ethylene glycol. Nat. Commun. 2023, 14, 1931.