Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA: Difference between revisions

From Wiki FKKT
Jump to navigationJump to search
No edit summary
 
(33 intermediate revisions by the same user not shown)
Line 5: Line 5:
RNAi je celični obrambni mehanizem, ki uravnava izražanje genov. Zavira izražanje genov z razgradnjo določenih mRNA, s čimer preprečuje sintezo ciljnih proteinov.  
RNAi je celični obrambni mehanizem, ki uravnava izražanje genov. Zavira izražanje genov z razgradnjo določenih mRNA, s čimer preprečuje sintezo ciljnih proteinov.  
Mehanizem so terapevtsko izkoristili z uporabo majhnih interferenčnih RNA (siRNA), ki omogočajo ciljno utišanje genov, povezanih z boleznimi. Visoka specifičnost in učinkovitost RNA interference pri utišanju genov je omogočila razvoj terapij na osnovi siRNA, namenjenih zdravljenju različnih bolezni, vključno z redkimi dednimi motnjami, določenimi vrstami raka ter virusnimi okužbami [1].
Mehanizem so terapevtsko izkoristili z uporabo majhnih interferenčnih RNA (siRNA), ki omogočajo ciljno utišanje genov, povezanih z boleznimi. Visoka specifičnost in učinkovitost RNA interference pri utišanju genov je omogočila razvoj terapij na osnovi siRNA, namenjenih zdravljenju različnih bolezni, vključno z redkimi dednimi motnjami, določenimi vrstami raka ter virusnimi okužbami [1].
Molekule siRNA za namen terapije so večinoma izdelane s kemično sintezo in pogosto vsebujejo umetne modifikacije za povečanje stabilnosti in zmanjšanje imunogenosti, kar pa lahko povzroči nepredvidene stranske učinke. Obstaja tudi tveganje za kontaminacijo z endotoksini. Zato se povečuje zanimanje za proizvodnjo bolj naravnih molekul siRNA, ki ohranjajo endogene lastnosti.
Molekule siRNA za namen terapije so večinoma sintetizirane kemijsko in pogosto vsebujejo umetne modifikacije za povečanje stabilnosti in zmanjšanje imunogenosti, kar pa lahko povzroči nepredvidene stranske učinke. Obstaja tudi tveganje za kontaminacijo z endotoksini. Zato se povečuje zanimanje za proizvodnjo bolj naravnih molekul siRNA, ki ohranjajo endogene lastnosti.
Raziskovalci so pa razvili metodo za bioinženiring molekul siRNA z uporabo bakterijske fermentacije. Metoda temelji na nosilcih pre-miRNA, združenih s tRNA, in omogoča proizvodnjo številnih bioinženirskih molekul siRNA v živih gostiteljskih celicah [2].
Raziskovalci so pa razvili metodo za bioinženiring molekul siRNA z uporabo bakterijske fermentacije. Metoda temelji na nosilcih pre-miRNA, združenih s tRNA, in omogoča proizvodnjo številnih bioinženirskih molekul siRNA v živih gostiteljskih celicah [2].


== Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA ==
== Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA ==
Novo razvito človeško tRNA za glicin z zaporedjem GCC (BioRNAGly) so povezali z optimiziranim zaporedjem pre-miR-34a, da bi ustvarili stabilen nosilec za majhne RNA molekule.
Človeško tRNA za glicin z zaporedjem GCC (BioRNAGly) so povezali z optimiziranim zaporedjem pre-miR-34a, da bi ustvarili stabilen nosilec za majhne RNA molekule.
tRNA/pre-miRNA nosilec zagotavlja strukturno stabilnost in omogoča učinkovito proizvodnjo ter procesiranje funkcionalnih molekul siRNA.
tRNA/pre-miRNA nosilec zagotavlja strukturno stabilnost in omogoča učinkovito proizvodnjo ter procesiranje funkcionalnih molekul siRNA.
Na tej osnovi so uspešno razvili devet različnih konstruktov BioRNA/siRNA, usmerjenih proti različnim genom. Kompleks tRNA/pre-miRNA služi kot nosilec za siRNA duplekse. Vsaka bioRNA/siRNA je bila izdelana z vstavitvijo specifičnega dupleksnega zaporedja siRNA namesto nativnega dupleksa miR-34a v skelet tRNA/pre-miRNA.
Na tej osnovi so uspešno razvili devet različnih konstruktov BioRNA/siRNA, usmerjenih proti različnim genom. Kompleks tRNA/pre-miRNA služi kot nosilec za siRNA duplekse. Vsaka BioRNA/siRNA je bila izdelana z vstavitvijo specifičnega dupleksnega zaporedja siRNA namesto nativnega dupleksa miR-34a v skelet tRNA/pre-miRNA.
Konstrukti so klonirali v vektor pBSTNAV in transformirali v celice ''E. coli'' HST08 za fermentacijo.
Konstrukte so vstavili v vektor pBSTNAV in transformirali v celice ''E. coli'' HST08.
S platformo so ustvarili panel devetih konstruktov BioRNA/siRNA, vključno z FDA odobrenimi terapevtiki (TTR-siRNA in ALAS1-siRNA), tudi kandidati v kliničnih ali prekliničnih študijah (VEGFR-siRNA, PD-1-siRNA, PD-L1-siRNA, BCL2-siRNA) in tri pogosto uporabljene siRNA v raziskavah (GFP-siRNA, Luciferase-siRNA, CDK6-siRNA).
S platformo so ustvarili panel devetih konstruktov BioRNA/siRNA, vključno z FDA odobrenimi terapevtiki (TTR-siRNA in ALAS1-siRNA), tudi kandidati v kliničnih ali prekliničnih študijah (VEGFR-siRNA, PD-1-siRNA, PD-L1-siRNA, BCL2-siRNA) in tri pogosto uporabljene siRNA v raziskavah (GFP-siRNA, Luciferase-siRNA, CDK6-siRNA).
Izvedli so fermentacije v majhnem (15 mL) in velikem (0,25 L) volumnu kultur. Z uporabo majhneg volumna kultur, z Urea-PAGE analizom so opazili prekomerno izražanje vsakega konstrukta BioRNA, ki so predstavljale več kot 50 % vseh RNA v vzorcu in 100% uspešnost pri vseh konstruktih.
Izvedli so fermentacije v majhnem (15 mL) in velikem (0,25 L) volumnu kultur. Z Urea-PAGE analizo in z uporabo majhneg volumna kultur so opazili prekomerno izražanje vsakega konstrukta BioRNA, ki so predstavljale več kot 50 % vseh RNA v vzorcu in 100% uspešnost pri vseh konstruktih.
Po potrditvi izražanja so povečali volumen kultur za proizvodnjo večjih količin vsake BioRNA/siRNA za prečiščevanje in funkcionalno testiranje. Za vsak konstrukt so gojili kulture ''E. coli ''(250 ml) in iz odvzetih celic izolirali skupno RNA.  
Po potrditvi izražanja so povečali volumen kultur za proizvodnjo večjih količin vsake BioRNA/siRNA za izolacijo in testiranje. Za vsak konstrukt so gojili kulture ''E. coli ''(250 ml) in iz odvzetih celic izolirali skupno RNA.  
Za prečiščevanje siRNA so uporabili kromatografijo FPLC.
Za čiščenje siRNA so uporabili kromatografijo FPLC.
Čistost so ocenili z urea-PAGE in HPLC; vsi BioRNA/siRNA so dosegli >98 % čistost. Tudi so izmerili endotoksine z LAL testom in so vsi vzorci imeli nizko aktivnost endotoksinov (<5 EU/μg RNA).  
Čistost so ocenili z urea-PAGE in HPLC in vsi BioRNA/siRNA so dosegli >98 % čistost. Tudi so izmerili endotoksine z LAL testom in so vsi vzorci imeli nizko aktivnost endotoksinov (<5 EU/μg RNA).  
Zagotavljanje nizke vsebnosti endotoksinov je bistvenega pomena za uporabo RNA v terapevtske namene, saj lahko bakterijski endotoksini sprožijo močne vnetne odzive.
Zagotavljanje nizke vsebnosti endotoksinov je bistvenega pomena za uporabo RNA v terapevtske namene, saj lahko bakterijski endotoksini sprožijo močne vnetne odzive.
Izkoristek iz 0,25 l kulture je bil od približno 3 mg do 10 mg prečiščene RNA na konstrukt [2].
Izkoristek iz 0,25 l kulture je bil od približno 3 mg do 10 mg prečiščene RNA na konstrukt [2].


== Funkcionalno utišanje genov s siRNA ==  
== Utišanje genov s siRNA ==  


Preverili so, če biološko ustvarjene siRNA funkcionalno sposobne utišati gene v celicah. Testirali so tri reprezentativne bioRNA/siRNA v celičnih testih: BioRNA/GFP-siRNA, BioRNA/BCL2-siRNA in BioRNA/PD-L1-siRNA. GFP-siRNA je izbran zaradi svoje pogoste uporabe v raziskovalne namene, BCL2-siRNA kot terapevtski kandidat pri raku  in PD-L1-siRNA kot imunoterapevtski pristop v onkologiji. Ocenili so uspešnost glede na njeno sposobnost zorenja v aktivno obliko siRNA v človeških celicah in zmanjšanja izražanja ciljnega gena [2].
Preverili so, če biološko ustvarjene siRNA sposobne utišati gene v celicah. Testirali so tri reprezentativne BioRNA/siRNA v celičnih testih: BioRNA/GFP-siRNA, BioRNA/BCL2-siRNA in BioRNA/PD-L1-siRNA. GFP-siRNA je izbran zaradi svoje pogoste uporabe v raziskovalne namene, BCL2-siRNA kot terapevtski kandidat pri raku  in PD-L1-siRNA kot imunoterapevtski pristop v onkologiji. Ocenili so uspešnost glede na njeno sposobnost zorenja v aktivno obliko siRNA v človeških celicah in zmanjšanja izražanja ciljnega gena [2].


=== BioRNA/GFP-siRNA ===
=== BioRNA/GFP-siRNA ===


Za preverjanje aktivnosti BioRNA/GFP-siRNA, je bila eksperimentalna strategija transfekcija bioinženirske RNA v linije rakavih celic, ki izražajo izboljšani zeleni fluorescenčni protein (EGFP). Uporabljeni so bili trije različni modeli celic, ki izražajo GFP, iz različnih vrst raka (A549, Huh7, 143B).
Za preverjanje aktivnosti BioRNA/GFP-siRNA so naredili transfekcijo bioinženirske RNA v linije rakavih celic, ki izražajo zeleni fluorescenčni protein (GFP). Uporabili so tri modele celic, ki izražajo GFP in sicer iz različnih vrst raka (A549-GFP-Luc, Huh7-GFP-Luc ter 143B-GFP-Luc celice).
Spremljali so raven izražanja GFP s fluorescenčno mikroskopijo in kvantitativno analizo slik ob 24, 48 in 72 urah po transfekciji. Rezultati so pokazali izrazito zmanjšanje fluorescence GFP že 24 ur po obdelavi z BioRNA/GFP-siRNA v primerjavi s kontrolo. Po 48 in 72 urah po obdelavi z BioRNA je bila pri celicah opazna dodatna redukcija GFP signala, kar nakazuje postopno utišanje izražanja reporterja. V vseh testiranih celičnih linijah je zaznan časovni potek zmanjševanja fluorescence, kar potrjuje, da je vnesena BioRNA stabilna in funkcionalna ter ohranja funkcijo vsaj več dni po transfekciji. Pri celicah, tretiranih s kontrolo, ter pri netretiranih celicah ni prišlo do opaznih sprememb v izražanju GFP. To potrjuje, da je utišanje rezultat delovanja siRNA specifične za GFP in da lahko sredstva BioRNA/siRNA vstopijo v človeške celice in sproščajo funkcionalne siRNA [2].
Spremljali so raven izražanja GFP s fluorescenčno mikroskopijo in kvantitativno analizo slik ob 24, 48 in 72 ur po transfekciji. Rezultati so pokazali izrazito zmanjšanje fluorescence GFP že 24 ur po transfekciji z BioRNA/GFP-siRNA v primerjavi s kontrolo.  
Po 48 in 72 urah po transfekciji z BioRNA so v celicah opazili dodatno redukcijo GFP signala, kar nakazuje na postopno utišanje izražanja reporterja. V vseh testiranih celičnih linijah so opazili postopno zmanjševanje fluorescence skozi čas, kar potrjuje, da je vnesena BioRNA stabilna, funkcionalna in ohranja funkcijo vsaj več dni po transfekciji. Pri celicah, tretiranih s kontrolo, ter pri netretiranih celicah ni prišlo do opaznih sprememb v izražanju GFP. To potrjuje, da je utišanje rezultat delovanja siRNA specifične za GFP in da lahko sredstva BioRNA/siRNA vstopijo v človeške celice in sproščajo funkcionalne siRNA [2].


=== BioRNA/BCL2-siRNA ===
=== BioRNA/BCL2-siRNA ===


Potem so testirali BioRNA konstrukt z siRNA zaporedjem, usmerjenim proti BCL2 (BioRNA/BCL2-siRNA), in ga primerjali s kemično sintetizirano siRNA enakega zaporedja. BCL2 (''angl.'' B-cell lymphoma 2) je onkogen, ki omogoča rakavim celicam izogniti se apoptozi. Ker utišanje gena BCL2 lahko sproži apoptozo v tumorskih celicah, ta predstavlja pomembno terapevtsko tarčo pri zdravljenju raka.
Nato so testirali konstrukt BioRNA/BCL2-siRNA in ga primerjali s kemično sintetizirano siRNA enakega zaporedja. BCL2 (''angl.'' B-cell lymphoma 2) je onkogen, ki rakavim celicam omogoča izogibanje apoptozi. Ker lahko utišanje gena BCL2 sproži apoptozo v tumorskih celicah, je le-ta pomembna terapevtska tarča pri zdravljenju raka.
Izvedli so transfekcijo človeških celic nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) z BioRNA/BCL2-siRNA, s kemično sintetizirano siRNA BCL2 ter z ustreznimi kontrolami. Uporabili so RT-qPCR z lasnično zanko (''angl.'' stem-loop RT-qPCR), ki omogoča natančno pomnoževanje zrele oblike zaporedja siRNA proti BCL2. Po 48 urah po transfekciji so zaznali prisotnost zrele oblike siRNA proti BCL2 tako v celicah, tretiranih z BioRNA/BCL2-siRNA kot s sintetično siRNA. Vendar je zanimivo, da so celice, obdelane z BioRNA/BCL2-siRNA, pokazale bistveno višje ravni zrele siRNA kot celice, obdelane s sintetično siRNA (pri enaki koncentraciji 15 nM). Ta rezultat nakazuje, da je biološko zasnovana RNA morda bolj učinkovito sprejeta ali morda bolj stabilna kot sintetična oblika. Po meritvi izražanja gena BCL2 po 48-72 urah, je BioRNA/siRNA pokazala enako ali večjo učinkovitost utišanja genov v primerjavi z običajnimi siRNA.  
Izvedli so transfekcijo človeških celic nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) z BioRNA/BCL2-siRNA, s kemično sintetizirano siRNA BCL2 ter z ustreznimi kontrolami. Uporabili so RT-qPCR z oligonukleotidom steblo-zanka (''angl.'' stem-loop RT-qPCR), ki omogoča natančno pomnoževanje zrele oblike zaporedja siRNA proti BCL2. Po 48 urah po transfekciji so zaznali prisotnost zrele oblike siRNA proti BCL2 tako v celicah, transfeciranih z BioRNA/BCL2-siRNA kot s sintetično siRNA. Zanimivo je dejstvo, da so celice, transfecirane z BioRNA/BCL2-siRNA, pokazale bistveno višje ravni zrele siRNA kot celice, transfecirane s sintetično siRNA (pri enaki koncentraciji 15 nM). Ta rezultat nakazuje, da je biološko zasnovana RNA morda učinkoviteje sprejeta in stabilnejša od sintetične oblike. Po meritvi izražanja gena BCL2 po 48-72 urah, je BioRNA/siRNA pokazala enako ali večjo učinkovitost utišanja genov v primerjavi z običajnimi siRNA.  
Obe siRNA sta učinkovito znižali raven BCL2 mRNA. Natančneje, BioRNA/BCL2-siRNA je v dveh celičnih linijah NSCLC zmanjšala raven BCL2 mRNA za približno 70-80 %, raven proteinov pa za 60-75 %, kar je bilo enako ali boljše od utišanja, doseženega s sintetično siRNA. Te ugotovitve so izjemno pomembne, saj kažejo, da biološko sintetizirana siRNA ne le učinkovito opravlja svojo funkcijo, temveč jo lahko celo preseže v primerjavi s standardno sintetično siRNA. Razlog za povečano učinkovitost BioRNA v celici bi lahko izhajal iz ohranjene strukture pre-miRNA, kar bi olajšalo prepoznavo encimu Dicer, ali pa iz odsotnosti kemičnih modifikacij, ki lahko pri sintetičnih oblikah ovirajo nadaljnjo obdelavo [2].
Obe siRNA sta učinkovito znižali raven BCL2 mRNA. Natančneje, BioRNA/BCL2-siRNA je v dveh celičnih linijah NSCLC zmanjšala raven BCL2 mRNA za približno 70-80 %, raven proteinov pa za 60-75 %, kar je bilo enako ali boljše od utišanja, doseženega s sintetično siRNA. Te ugotovitve nakazujejo na to, da biološko sintetizirana siRNA ne le učinkovito opravlja svojo funkcijo, temveč je sposobna celo preseči delovanje standardne sintetične siRNA. Razlog za povečano učinkovitost BioRNA v celici bi lahko ležal v ohranjenosti strukture pre-miRNA, kar bi encimu Dicer olajšalo prepoznavanje. Lahko pa gre tudi za odsotnost kemičnih modifikacij, ki lahko pri sintetičnih oblikah ovirajo nadaljnjo obdelavo [2].


=== BioRNA/PD-L1-siRNA ===  
=== BioRNA/PD-L1-siRNA ===  
Preverili so tudi delovanje BioRNA/PD-L1-siRNA v okviru imunoterapije raka. PD-L1 (''angl.'' programmed death-ligand 1) je protein, izražen v tumorskih celicah, ki se veže na PD-1 na celicah T in zavira imunski odziv. Blokiranje PD-L1 je mehanizem za več bioloških zdravil za raka, ki jih je odobrila FDA. Naredili so transfekcija BioRNA/PD-L1-siRNA v celice NSCLC in ovarijske celice kitajskega hrčka (CHO). Selektivna analiza z RT-qPCR metodo je po 48 urah potrdila izrazito prisotnost zrele oblike siRNA, usmerjene proti PD-L1.  
Preverili so tudi delovanje BioRNA/PD-L1-siRNA v okviru imunoterapije raka. PD-L1 (''angl.'' programmed death-ligand 1) je protein, ki ga izražajo tumorske celice in se veže na PD-1 na T celicah in zavira imunski odziv. Blokiranje PD-L1 je mehanizem po katerem delujejo mnoga biološka zdravila za raka, odobrena s strani FDA. Naredili so transfekcijo BioRNA/PD-L1-siRNA v celice NSCLC in ovarijske celice kitajskega hrčka (CHO). Selektivna analiza z RT-qPCR metodo je po 48 urah potrdila močno prisotnost zrele oblike siRNA, usmerjene proti PD-L1.  
Tudi kasnejše analize RT-qPCR in Western blot so pokazale znatno znižanje ravni mRNA PD-L1 (30-60 %) in proteina (70-80 %) v primerjavi s kontrolnim zdravljenjem. Imunofluorescenčna analiza je dodatno potrdila te ugotovitve, saj so pokazale zmanjšano izražanje PD-L1 na celični membrani [2].
Tudi kasnejše analize RT-qPCR in Western blot so pokazale znatno znižanje ravni mRNA PD-L1 (30-60 %) in proteina (70-80 %) v primerjavi s kontrolo. Imunofluorescenčna analiza je le potrdila predhodne ugotovitve, saj je pokazala zmanjšano izražanje PD-L1 na celični membrani [2].


Za oceno posledic zmanjšanja izražanja PD-L1 so uporabili reporterski test, ki meri prekinitev signalizacije PD-1/PD-L1. V eksperimentu so uporabili gensko spremenjene T-celice Jurkat, ki izražajo PD-1 in celice CHO, ki prekomerno izražajo PD-L1.Ta test, ki posnema interakcije med T-celicami in tumorskimi celicami, je pokazal, da je BioRNA/PD-L1-siRNA učinkovito zmanjšala izražanje PD-L1, obnovila signalizacijo T-celičnih receptorjev in aktivirala nadaljnje imunske odzive, kar se kaže v povečani luminiscenci. Torej BioRNA/PD-L1-siRNA ne le utiša ciljni gen, temveč tudi sproži imunsko aktivacijo z možnim antitumorskim učinkom [2].
Za oceno posledic zmanjšanja izražanja PD-L1 so uporabili reporterski test, ki meri prekinitev signalizacije PD-1/PD-L1. V eksperimentu so uporabili gensko spremenjene T-celice Jurkat, ki izražajo PD-1 in celice CHO, ki prekomerno izražajo PD-L1. Test, ki posnema interakcije med T-celicami in tumorskimi celicami, je pokazal, da je BioRNA/PD-L1-siRNA uspešno zmanjšala izražanje PD-L1, obnovila signalizacijo T-celičnih receptorjev in aktivirala nadaljnje imunske odzive, kar se kaže v povečani luminiscenci. BioRNA/PD-L1-siRNA torej ne zgolj utiša ciljni gen, temveč tudi sproži imunsko aktivacijo z mogočim antitumorskim učinkom [2].


== Zaključek ==
== Zaključek ==
Terapija z RNAi predstavlja obetavno zdravljenje prej neozdravljivih bolezni, vključno z genetskimi motnjami, boleznimi srca in ožilja, rakom, sladkorno boleznijo in virusnimi okužbami. Nedavne odobritve FDA in številne klinične študije poudarjajo njen naraščajoči terapevtski potencial. V študiji so Batra in sod. uspešno uporabili inovativen bioinženirski pristop z uporabo nosilca pre-miRNA s človeško tRNA, izraženega z bakterijsko fermentacijo, za proizvodnjo funkcionalnih BioRNA/siRNA. Ta se razlikuje od kemično sintetiziranih siRNA, saj so v živih celicah podvržena naravnim posttranskripcijskim modifikacijam, pri čemer fizikalno-kemijske lastnosti, biološka aktivnost in varnostni profili odražajo naravne značilnosti RNA. Pokazali so, da proizvedena BioRNA/siRNA učinkovito uravnavava izražanje ciljnih genov, kar ponuja trajnostno in stroškovno učinkovito strategijo za proizvodnjo siRNA. Ta napredek bistveno izboljšuje terapevtske možnosti, kar ima pomembne posledice za širok spekter bolezni in pospešuje uporabo sintezne biologije [2].
Prihodnost terapija z RNAi je obetavna in odpira nove možnosti za zdravljenje prej neozdravljivih bolezni, vključno z genetskimi motnjami, boleznimi srca in ožilja, rakom, sladkorno boleznijo in virusnimi okužbami. Nedavne odobritve s strani FDA in številne klinične študije poudarjajo njen naraščajoči terapevtski potencial. Batra in sod. so so v raziskavi uspešno uporabili inovativen bioinženirski pristop z uporabo nosilca pre-miRNA s človeško tRNA, za proizvodnjo funkcionalnih BioRNA/siRNA. Slednje se razlikujejo od kemično sintetiziranih siRNA, ker so v živih celicah podvržene naravnim posttranskripcijskim modifikacijam, pri čemer fizikalno-kemijske lastnosti in biološka aktivnost odražavajo naravne značilnosti RNA. Pokazali so, da proizvedena BioRNA/siRNA učinkovito uravnavava izražanje ciljnih genov, kar ponuja trajnostno in cenovno ugodno strategijo za proizvodnjo siRNA.  
Metoda naredi velik korak naprej za terapevtske možnosti, kar ima pomembne posledice za širok spekter bolezni [2].
 
== Literatura ==
== Literatura ==
[1] S. Malakondaiah, A. Julius, D. Ponnambalam, S. S. Gunthoti, J. Ashok, P. S. Krishana, J. Rebecca: Gene silencing by RNA interference: a review. Genome Instability & Disease 2024 5:5 '''2024''', 5, 225–241.
[1] S. Malakondaiah, A. Julius, D. Ponnambalam, S. S. Gunthoti, J. Ashok, P. S. Krishana, J. Rebecca: Gene silencing by RNA interference: a review. Genome Instability & Disease 2024 5:5 '''2024''', 5, 225–241.


[2] N. Batra, M. J. Tu, A. M. Yu: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents. ACS Synth Biol '''2024''', 13, 1906–1915.
[2] N. Batra, M. J. Tu, A. M. Yu: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents. ACS Synth Biol '''2024''', 13, 1906–1915.

Latest revision as of 19:48, 19 May 2025

Izhodiščni članek: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents

Uvod

RNAi je celični obrambni mehanizem, ki uravnava izražanje genov. Zavira izražanje genov z razgradnjo določenih mRNA, s čimer preprečuje sintezo ciljnih proteinov. Mehanizem so terapevtsko izkoristili z uporabo majhnih interferenčnih RNA (siRNA), ki omogočajo ciljno utišanje genov, povezanih z boleznimi. Visoka specifičnost in učinkovitost RNA interference pri utišanju genov je omogočila razvoj terapij na osnovi siRNA, namenjenih zdravljenju različnih bolezni, vključno z redkimi dednimi motnjami, določenimi vrstami raka ter virusnimi okužbami [1]. Molekule siRNA za namen terapije so večinoma sintetizirane kemijsko in pogosto vsebujejo umetne modifikacije za povečanje stabilnosti in zmanjšanje imunogenosti, kar pa lahko povzroči nepredvidene stranske učinke. Obstaja tudi tveganje za kontaminacijo z endotoksini. Zato se povečuje zanimanje za proizvodnjo bolj naravnih molekul siRNA, ki ohranjajo endogene lastnosti. Raziskovalci so pa razvili metodo za bioinženiring molekul siRNA z uporabo bakterijske fermentacije. Metoda temelji na nosilcih pre-miRNA, združenih s tRNA, in omogoča proizvodnjo številnih bioinženirskih molekul siRNA v živih gostiteljskih celicah [2].

Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA

Človeško tRNA za glicin z zaporedjem GCC (BioRNAGly) so povezali z optimiziranim zaporedjem pre-miR-34a, da bi ustvarili stabilen nosilec za majhne RNA molekule. tRNA/pre-miRNA nosilec zagotavlja strukturno stabilnost in omogoča učinkovito proizvodnjo ter procesiranje funkcionalnih molekul siRNA. Na tej osnovi so uspešno razvili devet različnih konstruktov BioRNA/siRNA, usmerjenih proti različnim genom. Kompleks tRNA/pre-miRNA služi kot nosilec za siRNA duplekse. Vsaka BioRNA/siRNA je bila izdelana z vstavitvijo specifičnega dupleksnega zaporedja siRNA namesto nativnega dupleksa miR-34a v skelet tRNA/pre-miRNA. Konstrukte so vstavili v vektor pBSTNAV in transformirali v celice E. coli HST08. S platformo so ustvarili panel devetih konstruktov BioRNA/siRNA, vključno z FDA odobrenimi terapevtiki (TTR-siRNA in ALAS1-siRNA), tudi kandidati v kliničnih ali prekliničnih študijah (VEGFR-siRNA, PD-1-siRNA, PD-L1-siRNA, BCL2-siRNA) in tri pogosto uporabljene siRNA v raziskavah (GFP-siRNA, Luciferase-siRNA, CDK6-siRNA). Izvedli so fermentacije v majhnem (15 mL) in velikem (0,25 L) volumnu kultur. Z Urea-PAGE analizo in z uporabo majhneg volumna kultur so opazili prekomerno izražanje vsakega konstrukta BioRNA, ki so predstavljale več kot 50 % vseh RNA v vzorcu in 100% uspešnost pri vseh konstruktih. Po potrditvi izražanja so povečali volumen kultur za proizvodnjo večjih količin vsake BioRNA/siRNA za izolacijo in testiranje. Za vsak konstrukt so gojili kulture E. coli (250 ml) in iz odvzetih celic izolirali skupno RNA. Za čiščenje siRNA so uporabili kromatografijo FPLC. Čistost so ocenili z urea-PAGE in HPLC in vsi BioRNA/siRNA so dosegli >98 % čistost. Tudi so izmerili endotoksine z LAL testom in so vsi vzorci imeli nizko aktivnost endotoksinov (<5 EU/μg RNA). Zagotavljanje nizke vsebnosti endotoksinov je bistvenega pomena za uporabo RNA v terapevtske namene, saj lahko bakterijski endotoksini sprožijo močne vnetne odzive. Izkoristek iz 0,25 l kulture je bil od približno 3 mg do 10 mg prečiščene RNA na konstrukt [2].

Utišanje genov s siRNA

Preverili so, če biološko ustvarjene siRNA sposobne utišati gene v celicah. Testirali so tri reprezentativne BioRNA/siRNA v celičnih testih: BioRNA/GFP-siRNA, BioRNA/BCL2-siRNA in BioRNA/PD-L1-siRNA. GFP-siRNA je izbran zaradi svoje pogoste uporabe v raziskovalne namene, BCL2-siRNA kot terapevtski kandidat pri raku in PD-L1-siRNA kot imunoterapevtski pristop v onkologiji. Ocenili so uspešnost glede na njeno sposobnost zorenja v aktivno obliko siRNA v človeških celicah in zmanjšanja izražanja ciljnega gena [2].

BioRNA/GFP-siRNA

Za preverjanje aktivnosti BioRNA/GFP-siRNA so naredili transfekcijo bioinženirske RNA v linije rakavih celic, ki izražajo zeleni fluorescenčni protein (GFP). Uporabili so tri modele celic, ki izražajo GFP in sicer iz različnih vrst raka (A549-GFP-Luc, Huh7-GFP-Luc ter 143B-GFP-Luc celice). Spremljali so raven izražanja GFP s fluorescenčno mikroskopijo in kvantitativno analizo slik ob 24, 48 in 72 ur po transfekciji. Rezultati so pokazali izrazito zmanjšanje fluorescence GFP že 24 ur po transfekciji z BioRNA/GFP-siRNA v primerjavi s kontrolo. Po 48 in 72 urah po transfekciji z BioRNA so v celicah opazili dodatno redukcijo GFP signala, kar nakazuje na postopno utišanje izražanja reporterja. V vseh testiranih celičnih linijah so opazili postopno zmanjševanje fluorescence skozi čas, kar potrjuje, da je vnesena BioRNA stabilna, funkcionalna in ohranja funkcijo vsaj več dni po transfekciji. Pri celicah, tretiranih s kontrolo, ter pri netretiranih celicah ni prišlo do opaznih sprememb v izražanju GFP. To potrjuje, da je utišanje rezultat delovanja siRNA specifične za GFP in da lahko sredstva BioRNA/siRNA vstopijo v človeške celice in sproščajo funkcionalne siRNA [2].

BioRNA/BCL2-siRNA

Nato so testirali konstrukt BioRNA/BCL2-siRNA in ga primerjali s kemično sintetizirano siRNA enakega zaporedja. BCL2 (angl. B-cell lymphoma 2) je onkogen, ki rakavim celicam omogoča izogibanje apoptozi. Ker lahko utišanje gena BCL2 sproži apoptozo v tumorskih celicah, je le-ta pomembna terapevtska tarča pri zdravljenju raka. Izvedli so transfekcijo človeških celic nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) z BioRNA/BCL2-siRNA, s kemično sintetizirano siRNA BCL2 ter z ustreznimi kontrolami. Uporabili so RT-qPCR z oligonukleotidom steblo-zanka (angl. stem-loop RT-qPCR), ki omogoča natančno pomnoževanje zrele oblike zaporedja siRNA proti BCL2. Po 48 urah po transfekciji so zaznali prisotnost zrele oblike siRNA proti BCL2 tako v celicah, transfeciranih z BioRNA/BCL2-siRNA kot s sintetično siRNA. Zanimivo je dejstvo, da so celice, transfecirane z BioRNA/BCL2-siRNA, pokazale bistveno višje ravni zrele siRNA kot celice, transfecirane s sintetično siRNA (pri enaki koncentraciji 15 nM). Ta rezultat nakazuje, da je biološko zasnovana RNA morda učinkoviteje sprejeta in stabilnejša od sintetične oblike. Po meritvi izražanja gena BCL2 po 48-72 urah, je BioRNA/siRNA pokazala enako ali večjo učinkovitost utišanja genov v primerjavi z običajnimi siRNA. Obe siRNA sta učinkovito znižali raven BCL2 mRNA. Natančneje, BioRNA/BCL2-siRNA je v dveh celičnih linijah NSCLC zmanjšala raven BCL2 mRNA za približno 70-80 %, raven proteinov pa za 60-75 %, kar je bilo enako ali boljše od utišanja, doseženega s sintetično siRNA. Te ugotovitve nakazujejo na to, da biološko sintetizirana siRNA ne le učinkovito opravlja svojo funkcijo, temveč je sposobna celo preseči delovanje standardne sintetične siRNA. Razlog za povečano učinkovitost BioRNA v celici bi lahko ležal v ohranjenosti strukture pre-miRNA, kar bi encimu Dicer olajšalo prepoznavanje. Lahko pa gre tudi za odsotnost kemičnih modifikacij, ki lahko pri sintetičnih oblikah ovirajo nadaljnjo obdelavo [2].

BioRNA/PD-L1-siRNA

Preverili so tudi delovanje BioRNA/PD-L1-siRNA v okviru imunoterapije raka. PD-L1 (angl. programmed death-ligand 1) je protein, ki ga izražajo tumorske celice in se veže na PD-1 na T celicah in zavira imunski odziv. Blokiranje PD-L1 je mehanizem po katerem delujejo mnoga biološka zdravila za raka, odobrena s strani FDA. Naredili so transfekcijo BioRNA/PD-L1-siRNA v celice NSCLC in ovarijske celice kitajskega hrčka (CHO). Selektivna analiza z RT-qPCR metodo je po 48 urah potrdila močno prisotnost zrele oblike siRNA, usmerjene proti PD-L1. Tudi kasnejše analize RT-qPCR in Western blot so pokazale znatno znižanje ravni mRNA PD-L1 (30-60 %) in proteina (70-80 %) v primerjavi s kontrolo. Imunofluorescenčna analiza je le potrdila predhodne ugotovitve, saj je pokazala zmanjšano izražanje PD-L1 na celični membrani [2].

Za oceno posledic zmanjšanja izražanja PD-L1 so uporabili reporterski test, ki meri prekinitev signalizacije PD-1/PD-L1. V eksperimentu so uporabili gensko spremenjene T-celice Jurkat, ki izražajo PD-1 in celice CHO, ki prekomerno izražajo PD-L1. Test, ki posnema interakcije med T-celicami in tumorskimi celicami, je pokazal, da je BioRNA/PD-L1-siRNA uspešno zmanjšala izražanje PD-L1, obnovila signalizacijo T-celičnih receptorjev in aktivirala nadaljnje imunske odzive, kar se kaže v povečani luminiscenci. BioRNA/PD-L1-siRNA torej ne zgolj utiša ciljni gen, temveč tudi sproži imunsko aktivacijo z mogočim antitumorskim učinkom [2].

Zaključek

Prihodnost terapija z RNAi je obetavna in odpira nove možnosti za zdravljenje prej neozdravljivih bolezni, vključno z genetskimi motnjami, boleznimi srca in ožilja, rakom, sladkorno boleznijo in virusnimi okužbami. Nedavne odobritve s strani FDA in številne klinične študije poudarjajo njen naraščajoči terapevtski potencial. Batra in sod. so so v raziskavi uspešno uporabili inovativen bioinženirski pristop z uporabo nosilca pre-miRNA s človeško tRNA, za proizvodnjo funkcionalnih BioRNA/siRNA. Slednje se razlikujejo od kemično sintetiziranih siRNA, ker so v živih celicah podvržene naravnim posttranskripcijskim modifikacijam, pri čemer fizikalno-kemijske lastnosti in biološka aktivnost odražavajo naravne značilnosti RNA. Pokazali so, da proizvedena BioRNA/siRNA učinkovito uravnavava izražanje ciljnih genov, kar ponuja trajnostno in cenovno ugodno strategijo za proizvodnjo siRNA. Metoda naredi velik korak naprej za terapevtske možnosti, kar ima pomembne posledice za širok spekter bolezni [2].

Literatura

[1] S. Malakondaiah, A. Julius, D. Ponnambalam, S. S. Gunthoti, J. Ashok, P. S. Krishana, J. Rebecca: Gene silencing by RNA interference: a review. Genome Instability & Disease 2024 5:5 2024, 5, 225–241.

[2] N. Batra, M. J. Tu, A. M. Yu: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents. ACS Synth Biol 2024, 13, 1906–1915.