FoCas

FoCas je projekt skupine iZJU iz Kitajske, ki je leta 2025 dosegla prvo mesto na tekmovanju iGEM.

Uvod

Odpornost mikroorganizmov na protimikrobna sredstva je v porastu. Odraža se v neučinkovitosti antibiotikov v konvencionalni rabi in v naraščajočih primerih tako imenovanih bolnišničnih okužb po svetu. Prav odporni patogeni so glavni vzrok za pojav zadnjih. Problematična pa ni samo njihova odpornost, ampak tudi zmožnost prenašanja odpornosti na neodporne populacije/seve in njihova visoka infektivnost. Umrljivost pri okužbah, ki jih povzročajo odporni patogeni, je 25 %, zato je potreba po reševanju problema odpornosti na protimikrobna sredstva velika.

Opis projekta

Skupina iZJU iz Kitajske je leta 2025 na tekmovanju iGEM zasnovala tehnologijo, ki bi omenjeni problem lahko reševala. FoCas deluje proti odpornosti mikroorganizmov na protimikrobna sredstva na način, da prepreči nastanek odpornega fenotipa in s tem tudi inhibira povečano infektivnost patogena. Gre za dvokomponentni sistem, sestavljen iz sistema CRISPR/Cas9 za natančno editiranje tarčnega gena (Cas) in iz nanostrukture DNA (DNA-origami), ki dostavi prvega na tarčno mesto (Fo). Pri tem DNA-origami zaobjame kompleks sgRNA/Cas9 in se specifično veže na tarčni mikroorganizem. Po vstopu v mikroorganizem se sistem CRISPR/Cas9 aktivira, temu pa sledi rezanje oz. inaktivacija tarčnega gena.

Za tarčni organizem so si tekmovalci izbrali na meticilin odporen Staphylococcus aureus oz. MRSA, saj predstavlja veliko epidemiološko breme. MRSA vsebuje gen za rezistenco na β-laktamske antibiotike, ki inhibirajo sintezo bakterijske celične stene. Omenjeni gen mecA zapisuje za transmembranski protein PBP2a (penicilin-vezavni protein 2a), ki je odgovoren za sintezo bakterijske celične stene, vendar ima zelo majhno afiniteto do laktamov. To pomeni, da β-laktamski antibiotiki njegovega delovanja ne omejujejo dovolj učinkovito. mecA se ponavadi nahaja na mobilnem genskem elementu SCCmec (staphylococcal cassette chromosome mec) in se lahko med populacijami prenaša s fagno transdukcijo in s konjugacijo.

FoCas bi po sintezi in vitro nanašali na rane (pooperativne brazgotine) topično ali v obliki pršila, pri tem pa bi dostavna komponenta sistema – DNA-origami – poskrbela za nalaganje, zaščito ter sproščanje sgRNA/Cas9, za specefično prepoznavanje patogena in za luknjanje bakterijske membrane. Delovanje tehnologije FoCas lahko opišemo v petih korakih: 1) zaščita pred npr. endogenimi proteazami pacienta, 2) tarčenje patogena z aptameri, 3) internalizacija sistema ob sintezi reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS) iz vodikovega peroksida, prisotnega na mestu rane, 4) sproščanje sgRNA/Cas9 z redukcijo DNA-origamija z glutationom in v prisotnosti bakterijske RNAze H, ter 5) rezanje tarčnega gena (mecA).

Načrtovanje

Za uporabo Cas9 se je ekipa odločila zato, ker prepoznava zaporedje PAM NGG. To se v veliki meri pojavlja v genu mecA (na SCCmec), kar bi po mnenju ekipe še dodatno prispevalo k specifičnosti rezanja. DNA-origami so skonstruirali in silico in in vitro. DNA-origami se nanaša na nanostrukturo, ki jo tvori DNA. Osnova je približno 7 kb dolga enoverižna (ponavadi virusna) DNA, ki se jo izoblikuje v točno določeno obliko s pomočjo »sponk« - kratkih enoverižnih DNA. Sponke se lahko vežejo na osnovo in med sabo povezujejo oddaljene konce. Struktura omogoča tudi vnašanje modifikacij, kar je ekipa izkoristila za načrtovanje drugih, že prej omenjenih funkcij. Postopek načrtovanja in sinteze DNA-origamija je sicer drag, vendar ima takšen način dostavljanja številne prednosti. DNA-origami se samosestavlja, je biokompatibilen, biorazgradljiv in predstavlja majhno tveganje za imunogenost in toksičnost. Tarčni organizem oz. tarčni gen so izbrali glede na epidemiološko breme patogena, pomen tarčnega gena za patogen, možnost detekcije, izvedljivost in literaturo. Epidemiološko breme odpornih patogenov so ocenili z računalniškim modelom, v katerega so vključili parametre za susceptibilnost, stopnjo širjenja okužb, stopnjo ozdravelosti, stopnjo umrljivosti itd. Kandidate za tarčne gene so izbirali glede na pojavnost v odpornih fenotipih in pomembnost za razvoj odpornosti. MRSA je predstavljala največje epidemiološko breme, prisotnost metA pa je skoraj korelirala s pojavnostjo odpornosti.

Tarčno zaporedje na genu mecA so določili s programom ChopChop. Z njim so ovrednotili tudi možnost off-target mest, ki je bila za izbrano zaporedje enaka nič. Glede na tarčno zaporedje so generirali zaporedje sgRNA, sintezo katerega so naročili pri podjetju Genscript.

Dostavni sistem (DNA-origami) so sintetizirali z uporabo genoma faga M13mp18 kot vodilne verige in enoverižnih sponk s počasnim prileganjem. Izbrali so obliko pravokotnika, saj jim je to omogočalo uvajanje velikega števila modifikacij. Za modelni organizem so izbrali E.coli MG1655, CRISPR/Cas9 pa so modificirali za tarčenje gena lacZ. sgRNA so modificirali na 3'-koncu z linkerjem, ki je bil komplementaren zaporedju sponk DNA-origamija. Stabilnost vezave so zagotovili tudi z vključkom komplementarnih regij za sgRNA v sponke origamija na 5'-konec. Na robovih so sponke odstranili, da so zagotovili čim več prostora za protein Cas9, za katerega so ocenili, da bi zavzemal ¼ premera valjaste nanostrukture DNA-origamija. 6 sponk na sredini strukture so modificirali tudi na način, da so vsebovale zaporedje PAM za Cas9. sgRNA za lacZ z linkerjem so sintetizirali iz matrice, ki so jo pomnožili s PCR in prepisali in vitro. Ugotovili so, da linker ne ovira funkcije kompleksa sgRNA/Cas9. Prečiščeno sgRNA so nato označili s FITC, ki fluorescira zeleno. Stabilnost DNA-origamija so preverili in silico s simulacijami molekulske dinamike. Simulacije so pokazale veliko stabilnost strukture v pogojih z visoko temperaturo. Sestavljanje nanostrukture so preverili z mikroskopom na atomsko silo. Na nanostrukturo so vezali tudi barvilo Cy5, ki fluorescira rdeče, kompleks sgRNA/Cas9 pa so označili z barvilom FITC. Nalaganje kompleksa sgRNA/Cas9 v DNA-origami so preverili z UV-VIS spektroskopijo (z vzbujanjem vezanih barvil).

Sistem za rušenje strukture bakterijske membrane temelji na G-kvadrupleksih, ki v kompleksu s heminom delujejo kot DNAcimi z aktivnostjo podobno hrenovi peroksidazi. G-bogate regije so pripeli na 3'-konec sponk za tvorjenje G-kvadrupleksov. Modifikacije so uvajali glede na že znane podatke o stabilnosti in učinkovitosti G4-hemin kompleksov. Hemin so dodali šele po vezanju G-bogatih regij na nanostrukturo. Uvedli so 136 takšnih mest. Nastajanje kompleksa G4-hemin so preverjali z UV-Vis spektroskopijo, saj hemin absorbira pri valovni dolžini 400 nm. Ker so G-kvadrupleksi nagnjeni k tvorjenju dimerov, so to preverili na gelski agarozni elektroforezi (AGE) in ugotovili, da do tvorjenja dimerov ni prišlo.

Primerne aptamere so iskali na dva načina – prek podatkovnih baz, in v literaturi. Tako za tarčni kot za modelni mikroorganizem so našli ustrezne aptamere za prepoznavanje proteina PBP2a. Aptamere so na DNA-origami pripeli s počasnim prileganjem prek linkerja na 3'-koncu aptamera, ki je bil komplementaren sponkam DNA-origamija. Izbrali so sponke na krajši stranici pravokotne nanostrukture, saj so podatki iz literature pokazali, da je specifičnost v tem primeru boljša. Učinkovitost delovanja aptamerov so spremljali posredno prek opazovanja fluorescence N-fenil-1-naftilamina (NPN), ki močno fluorescira v fosfolipidnem okolju in se uporablja za ovrednotenje integritete bakterijske membrane.

Nazadnje so na konce nanostrukture uvedli še enoverižni DNA sponki s komplementarnim zaporedjem, kar je omogočalo zvitje strukture. Sponke blizu koncev so modificirali tudi s tiolnimi skupinami, da bi ob zvitju prišlo še do tvorbe disulfidnih mostičkov, kar bi dodatno ojačalo povezavo. Glede na literaturo so ovrednotili postavitev tiolnih skupin kot nemotečo za funkcijo DNA-origamija, do nepravilnega parjenja pa prav tako ne bi smelo priti.

Rezultati

Nalaganje kompleksa sgRNA/Cas9 v DNA-origami je bilo uspešno. Internalizacijo sistema FoCas so potrdili s fluorescenčnim konfokalnim mikroskopom, ta pa je bila večja v prisotnosti aptamerov. Nazadnje so preverili še delovanje celotnega sistema FoCas proti genu lacZ na modelnem organizmu. Izvedli so belo-modri test. Na kontrolni plošči so bile prisotne samo modre kolonije, medtem ko so na plošči s sistemom FoCas zrasle tako bele kot modre kolonije.

Zaključek

Ekipa iZJU iz Kitajske je uspešno zasnovala tehnologijo FoCas in tudi sintetizirala njeni komponenti. Na modelnem organizmu so pokazali, da je sistem tudi funkcionalen in da tarči bakterije z visoko afiniteto. V prihodnje si ekipa želi tehnologijo prenesti v klinično rabo, zato bi bilo v naslednjih korakih nujno oceniti varnost tehnologije (tudi v prisotnosti človeških celic) in še naprej optimizirati specifičnost CRISPR/Cas9 sistema, da ne bi prišlo do off-target delovanja. In vitro testiranju bi nato lahko sledilo in vivo testiranje na živalskih modelih.

Viri

https://teams.igem.org/5913