Projekt Čovekov epigenom: Difference between revisions
(One intermediate revision by the same user not shown) | |||
Line 42: | Line 42: | ||
-občutljivost metode lahko povečamo z masno spektroskopijo | -občutljivost metode lahko povečamo z masno spektroskopijo | ||
-razvili zelo natančen in občutljiv test za detekcijo sledi metilcitozina v | -razvili zelo natančen in občutljiv test za detekcijo sledi metilcitozina v genomskii DNA; razgradnja DNA na nukleotide, očiščenje metilcitozina s HPLC, detekcija z 1-D ali 2-D kromatografijo | ||
'''''2. HPCE''''' | '''''2. HPCE''''' | ||
Line 55: | Line 55: | ||
-občutljivost povečamo z uporabo fluorescence in masne spektroskopije | -občutljivost povečamo z uporabo fluorescence in masne spektroskopije | ||
Ker nimamo vedno na voljo opreme za ti dve metodi, lahko poskus izvedemo tudi z radioaktivnim označevanjem CpG mest z uporabo metil- | Ker nimamo vedno na voljo opreme za ti dve metodi, lahko poskus izvedemo tudi z radioaktivnim označevanjem CpG mest z uporabo metil- akceptorskega testa | ||
'''''3. IN SITU HIBRIDIZACIJSKE METODE''''' | '''''3. IN SITU HIBRIDIZACIJSKE METODE''''' | ||
Line 69: | Line 69: | ||
-to je osnova za ločitev med metilirano in nemetilirano DNA | -to je osnova za ločitev med metilirano in nemetilirano DNA | ||
-bisulfidno | -bisulfidno preoblikovanje DNA lahko zasledujemo z različnimi metodami: sekveniranje, specifični metilacijski PCR v kombinaciji z bisulfidnimi restrikcijskimi testi | ||
-bisulfidne modifikacije DNA zathtevajo DNA pred denaturacijo, ker samo metilcitozini, ki so v posameznih snopih, so dovzetni za napad | -bisulfidne modifikacije DNA zathtevajo DNA pred denaturacijo, ker samo metilcitozini, ki so v posameznih snopih, so dovzetni za napad |
Latest revision as of 18:44, 18 April 2011
Uvod v Projekt človeški epigenom
Ko so imeli znanstveniki na prelomu tisočletja v rokah grobe osnutke genoma, so se kljub velikanskemu uspehu projekta Človeški genom porajala številna vprašanja. Ena stvar je namreč razvozlati genom, nekaj drugega pa je spoznati, kateri so tisti faktorji, ki odločajo kako je naš genom povezan s poznanimi karakteristikami našega fenotipa.
Zahvaljujoč projektu Človeški genom torej poznamo pozicijo genov v genomu, ne vemo pa kateri geni se v določenih tipih tkiv izražajo in kakšne kemijske spremembe to uravavajo. Tu nastopi področje imenovano epigenetika. Beseda epigenetika delno izvira iz Grščine in dobesedno pomeni 'nad genetiko'. Obstaja več različnih epigenetskih sprememb, vendar za zdaj najbolj razumemo metilacijo. Metilacija je edini fleksibilen genomski parameter, ki lahko izražanje genov spreminja na podlagi zunanjih dejavnikov (in ne podlagi spremembe nukleotidnega zaporedja). Ta proces tako predstavlja glavno, in do nedavnega manjkajočo povezavo med genetiko, boleznijo in vplivi okolja, za katere menijo, da predstavljajo enega glavnih vzrokov skorajda vseh bolezni. Nekateri viri celo navajajo, da kar 50% vzrokov za bolezen lahko pripišemo genetskim faktorjem. Epigenetske spremembe lahko nastanjeo zaradi več različnih zunanjih vzrokov, kot so prehranjevanje, stres ipd.
Metilacija se normalno pojavlja na citozinu v CpG dinukleotidnih zaporedjih in je vpletena v kontrolo pravilnega izražanja genov. Diferencialno metilirani citozini vodijo do različnih vzorcev, specifičnih za določene tipe tkiv in stanja bolezni, vključno z rakom. Za takšne variabilne pozicije metilacije (angl. MVP – Methylation variable positions) domnevajo, da odražajo gensko aktivnost, tip celic oziroma tkiv in stopnje bolezni ter so uporabni kot epigenetski markerji, ki odkrivajo dinamično stanje genoma. Prav zato laho različne vrste raka razvrstimo glede na stopnjo metilacije; tako tiste oblike raka z visoko stopnjo metilacije predstavljajo posebno klinično skupino, ki je okarakterizirana z epigenetsko nestabilnostjo. MVP so definirane kot CpG mesta s statistično močjo razlikovanja med različnimi biološkimi vzorci in/ali stanji. Podobno kot polimorfizmi posameznega nukleotida (SNP), tudi MVP obetajo pomemben prispevek pri napredku v razumevanju molekularnih osnov človeških bolezni.
Leta 2003 so znanstveniki z Britanskega instituta Wellcome Trust Sanger in biotehnološkega podjetja Epigenomics združili moči in ustanovili projekt Človeški Epigenom. Projekt človeški epigenom (The Human Epigenome Project – HEP) je multinacionalni znanstveni projekt, osnovan z namenom sistematične identifikacije, kategorizacije in interpretacije metilacijskih vzorcev DNA na vseh regulatornih regijah genov vzdolž človeškega genoma. Projekt je financiran tako z vladnih strani, kot tudi s strani privatnih vlagateljev, vodi pa ga konzorcij projekta Človeški epigenom. Poziv za nastanek tovrstnega projekta je prišel s strani številnih znanstvenikov iz celega sveta, ki se ukvarjajo predvsem s preučevanjem raka in rakastih obolenj. Z uspešnostjo takega projekta, bi lahko omogočili zdravnikom boljše diagnosticiranje bolezni, obenem pa tudi napredovanje na področju farmakogenetike, saj bi lahko potencialno proizvedli zdravila, ki bi bila sposobna spreminjati izražanje genov. Zadnje raziskave so pokazale, da je DNA metilacija v obdobju človekovega življenja veliko bolj stabilna kot so mislili.
Raziskave
Raziskave v epigenetiki poskušajo poglobiti razumevanje genske regulacije, ki ni direktno kodirana v DNA zaporedju. Znanih je več epigenetskih mehanizmov, kot so metilacije na DNA, remodeliranje kromatina in modifikacije na histonih, ki modulirajo pakiranje DNA v jedru in tako vplivajo na ekspresijo genov. Vzorci epigenetskih informacij se razmnožujejo v procesu celične delitve. Naključne in od okolja odvisne epigenetske napake imajo glavno vlogo pri staranju in raku, pripomorejo pa tudi k duševnim motnjam in avtoimunskim boleznim.
Najbolj obdelana epigenetska modifikacija pri človeku je metilacija citozina, ki se nahaja znotraj dinukleotida CpG. Pri normalnih človeških tkivih sestavlja DNA 5-metilcitozin 0,75-1% vseh nukleotidnih baz. Znano je tudi, da je pri normalni DNA približno 3-4% citozina metiliranega. CpG dinukleotidi niso naključno razporejeni v genomu, poznamo bogate regije s CpG, ki so ponavadi nemetilirane pri normalnih tkivih.
Projekt človeški epigenom je imel zastavljen cilj pridobitve podatkov vzorcev metilacije posameznih regij človeškega epigenoma pri normalnih in obolelih tkivih z metodo sekveniranja DNA z bisulfatom, pri čemer so uporabili PCR specifične za določen lokus. Pripravili so profile metilacije DNA vseh 3000 znanih človeških genomov na kromosomih 6, 13, 20 in 22 pri dvanajstih različnih tkivih ter tako prispevali k novim razumevanjem specifičnosti tkiv. Projekt je bil zastavljen, da identificira in opiše lastnosti DMR (diferenčno metilirane regije), ki pripomorejo k fenotipski raznolikosti. Tako sekveniranje z bisulfatom kot MeDIP tehnologija sta bili prilagojeni za uporabo z DNA mikromrežami. Pri tem so uporabili MHC kot modelni sistem za pregled DMR povezanih s specifičnimi tkivi za boljše razumevanja metilacije DNA pri genski ekspresiji določenih tkiv, za iskanje DMR povezanih z določenim fenotipom ter za razlago vloge epigenetske variacije pri kompleksnih boleznih.
Za podatke pridobljene pri tem projektu so ustvarili spletni brskalnik genov. Raven metilacije, ki je izračunana z algoritmom ESME, je prikazana v barvni matriki. Vrstice predstavljajo povprečja sekveniranja zaporedij različnih tkiv, stolpci pa predstavljajo posamezna CpG mesta. Izvedejo dvojno sekveniranje, kjer enkrat na podlagi fenotipa določajo gensko zaporedje, ki je zasnova za določeno lastnost in drugič na podlagi genskega zaporedja določajo možne fenotipske značilnosti, ki jih ta kodira (obratno sekveniranje). Vsak kvadratek matrike predstavlja povprečno raven matilacije pri posameznem CpG mestu določenega tkiva. Dodatne anotacije vključujejo koordinate kromosomov, CpG otočke, SNP (polimorfizmi posameznih nukleotidov), ROI (region of interest), zaporedja amplikonov (produkt PCR) in začetnih oligunukleotidov.
Metode in postopki metilacije DNA
1. HPLC
-Večina metilcitozina v genomski DNA je lahko analizirana s kemično hidrolizo
-hidrofluorična kislina za kemično hdrolizo DNA; preprečuje deaminacijo citozina in metilcitozina
- encimska hidroliza je boljša alternativa za merjenje stopnje DNA metilacije
- s HPLC se ločujejo deoksiribonukleotidi
-ta metoda se uporablja pri veliki večini živalih in rastlinah
-potrebna količina DNA za to metodo: 2,5 µg
- slabost: elucijski pufer se lahko v stolpcu obori
-občutljivost metode lahko povečamo z masno spektroskopijo
-razvili zelo natančen in občutljiv test za detekcijo sledi metilcitozina v genomskii DNA; razgradnja DNA na nukleotide, očiščenje metilcitozina s HPLC, detekcija z 1-D ali 2-D kromatografijo
2. HPCE
-ta metoda je boljša od HPLC, cenejša, prikazuje velik potencial za frakcioniranje
-kljub temu skoraj nobene pripravljalne analize niso možne s HPCE sistemom zaradi sodelujočih premajhnih volumnov -sprostitev baz iz DNA s kemičnim sredstvi vključuje produkcijo zapletenih mešanic molekul, ki otežujejo detekcijo metilcitozina, ko DNA ni dovolj prečiščena ali koncentrirana; temu problemu se lahko izognemo z encimsko hidrolizo z nukleazo P1 in alkalnimi fosfatazami
-pri vsebini 1µg lahko detektiramo 1 metilcitozin in 200 citozinov
-občutljivost povečamo z uporabo fluorescence in masne spektroskopije
Ker nimamo vedno na voljo opreme za ti dve metodi, lahko poskus izvedemo tudi z radioaktivnim označevanjem CpG mest z uporabo metil- akceptorskega testa
3. IN SITU HIBRIDIZACIJSKE METODE
-najbolj uporabljene metode temeljijo na metilacijsko občutljivih in neobčutljivih restrikcijskih endonukleazah
-eden izmed restrikcijskih encimov v paru je možen rezati DNA samo takrat, ko je njegova tarča nemetilirana(najbolj znan par je HpaII/MspI)
4. BISULFIDNE METODE
-bisulfid pretvori nemetiliran citozin v uracil, medtem ko metiliran citozin ne reagira
-to je osnova za ločitev med metilirano in nemetilirano DNA
-bisulfidno preoblikovanje DNA lahko zasledujemo z različnimi metodami: sekveniranje, specifični metilacijski PCR v kombinaciji z bisulfidnimi restrikcijskimi testi
-bisulfidne modifikacije DNA zathtevajo DNA pred denaturacijo, ker samo metilcitozini, ki so v posameznih snopih, so dovzetni za napad
5. COBRA
-visoko specifičen pristop za detekcijo tarč za restrikcijske endonukleaze po opravku z bisulfidi
-največja prednost: zagotavlja delno kvantitivne podatke o metilaciji na specifičnih delih v vsakem DNA vzorcu
6. OSTALE STRATEGIJE, KI NE TEMELJIJO NA BISULFIDIH
-modifikacije z metilacijo so lahko dosežene z uporabo hidrazina in permanganata; oba reagirata z ssDNA, odstrani se ju s piperidinom
-slabost: nista dosti občutljiva, potrebno je 2µg DNA
Rezultati in pridobljeni podatki
Študija prikazuje, da imajo monociti in limfociti različnih posameznikov, neglede na starost ali spol, stabilne, konsistentne in celično specifične vzorce metilacije na kodirajočih, promotorskih in CpG regijah na histonih. Precej verjetno lahko predpostavimo takšne značilnosti za celotni genom. Ti rezultati so analogni vzorcem genske ekspresije vendar so med njima ključne razlike. Profili genske ekspresije merijo tisoče RNA transkriptov simultano, profili metilacije na histonih podajajo informacije kromatina v genomu glede na tip uporabljenih mikromrež.
Povzetek rezultatov vključuje:
• Specifični tipi krvnih celic vzdržujejo vzorce metilacije na histonih, predvidoma tudi na epigenomu, vendar lahko k variaciji pripomorejo starost, spol in celično stanje.
• Vzorci metilacije glavnih genov v diferenciranih celicah so relativno stabilni in zelo verjetno dedni zato predvidoma obstajajo sistemi za popravljanje neravnovesja ali poškodb, ki vključujejo delecije ali spremembe v posttranslacijskih modifikacijah.
• Tako metilacije na histonih kot genske ekspresije imajo specifične vzorce za različne celične tipe, kar dokazuje, da posttranslacijske modifikacije na histonih kontrolirajo gensko ekspresijo.
• Histoni so obogateni v specifičnih genih pri določenih celičnih vrstah in specifičnih metabolnih poteh, kar nakazuje, da imajo metiltransferaze specifične za histone regulacijsko vlogo pri transkripciji teh genov.
• Človeške krvne celice ostajajo najbolj dosegljiv in najmanj invazivni vir človeškega tkiva, ki lahko nudi pomembne informacije kot so mutacije genoma in genske ekspresije, posebej v povezavi z imunskim in vnetnim odzivom.
• Posttranslacijske modifikacije na histonih imajo potencial, da postanejo informacijska baza podatkov za kromatin, nadgradimo pa jih lahko z izdelavo profilov teh kromatinskih markerjev v primarnih tkivih in celicah z uporabo ChIP-chip metode.
• Splošen profil metilacije MHC prikazuje več kot 90% analiziranih regij hiper- ali hipo-metiliranih MHC. 80% analiziranih CpG pri HEP prikazuje ravni metilacije, ki variirajo za več kot 20% med posamezniki ali/in tkivi. Regije navzgor po zaporedju genoma so bolj verjetno hipometilirane v primerjavi z intronskimi regijami, eksoni pa so bolj verjeno metilirani od intronov. Primerjava DNA metilacije z ravnijo ekspresije za MHC gene pri različnih tkivih prikazuje povezavo hipermetilacije regij navzgor po zaporedju z utišanjem genov.
Prihodnost
Potencial tega projekta v prihodnosti je precejšen. Poleg obširnih bazičnih raziskav, ima epigenom aplikativno možnost ne samo za diagnostiko, marveč ob potencialnih reverzibilnih epigenetskih procesih tudi pri terapevtskih namenih. Take terapije predvidevajo uporabo DNA metilacijskih inhibitorjev, ki preprečijo utišanje genov. Kot vir podatkov zagotavlja HEP ključno podlago tudi za nadalnje mapiranje pri raziskavah raka in ostalih kompleksnih bolezni.
Viri
[1] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC529316/?tool=pubmed
[2] http://cancerres.aacrjournals.org/content/65/24/11241.full
[3] http://www.jimmunol.org/content/180/4/2264.full
[4] http://www.biomedsearch.com/attachments/00/19/32/58/19325872/pgen.1000438.pdf
[5] http://www.biotechniques.com/multimedia/archive/00011/02333rv01_11833a.pdf