Analiza metilacijskih vzorcev na DNA

Epigenetika preučuje spremembe v kromatinu, ki niso posledice mutacij. Večina znanstvenikov tega področja se ukvarja z preučevanjem histonskih modifikacij, ter DNA metilacije, dveh najpogostejših molekularnih mehanizmov, ki sta pogosto prepletena. DNA metilacija vpliva na ekspresijo genov z večanjem afinitete vezave metilcitozin-vezavnih proteinov in/ali induciranjem sprememb kromatinske strukture. Pri višjih evkariontih DNA metilacija poteka na 5' koncu citozinske baze v CpG dinukleotidu. V nadaljevanju bomo predstavili nekatere izmed analitskih tehnik, ki jih uporabljamo za analizo kromatinskih sprememb.

Metode za analizo arhitekture kromatina

Kromatin imunoobarjalni test

Velik napredek v analizi kromatinskih sprememb se je zgodil z razvitjem kromatin imunoobarjalnega (ChIP) testa. ChIP je postopek, s katerim ugotavljamo, ali se določen protein veže na specifično DNA zaporedje in vivo. Pri tej tehniki najprej razbijemo kromatin na manjše koščke, z protitelesi proti iskanemu DNA vezavnemu proteinu označimo kose, ki nas zanimajo, ter te komplekse oborimo. Nato ločimo proteine od DNA. DNA nato obdelamo z semi-kvantitativno PCR. S tem lahko določimo arhitekturo kromatina specifičnega DNA zaporedja. Tehnika ima dva glavna tipa: nChIP, ki se uporablja za preučevanje proteinov, ki se na DNA vežejo z veliko afiniteto, ter xChIP, ki se pa uporablja za proteine, ki se na DNA vežejo z majhno afiniteto. Z kombiniranjem teh testov z DNA čipi pa se preučujejo globalne DNA-protein interakcije. Metoda, ki kombinira ChIP ter Q-PCR se uporablja za določevanje obsega histonske acetilacije na diskretnih regijah jedrne DNA. Ta metoda je bila uporabljena v študiji vpliva metilacije nukleotidov na transkripcijo, ter na lokalno strukturo kromatina. Pokazalo se je, da so acetilirani histoni redki na predelih metilirane DNA, ter pogosti na nemetiliranih regijah DNA istega gena.

Poleg metod, ki temeljijo na testu ChIP, obstaja veliko drugih tehnik analize in opredelitve kromatinskih sprememb med epigenetskimi proces.

DNazaI hiperobčutljivi test

Z DNazaI hiperobčutljivimi testi se preučujejo spremembe v strukturi kromatina, povezane z aktivacijo transkripcije specifičnih genov med pomembnimi biološkimi procesi (npr. diferenciacija celic). Test je pomemben za epigenetske raziskave, ker je ekspresija genov tesno povezana z metilacijo DNA ter histonskimi modifikacijami.

Mikrokokalna nukleaza

To je restrikcijska endonukleaza, ki jo uporabljajo za cepitev kromatina pri evkariontih, predvsem za identifikacijo lokacije nukleosomov kateregakoli gena

Pomen poznavanja kromatinske strukture

Poznavanje kromatinske strukture in njegove funkcije pomembmno za vrednotenje sprememb v genski aktivnosti. Sprememba genske aktivnosti je odvisna tudi od histonov acetilaze in deacetilaze (HDAC - Histone deacetylases), ki acetilirata promotor gena. V tej tehniki je pogosto uporabljen trihostatin A (TSA), to je hidroksamična kislina, ki inhibira HDAC pri nizkih koncentracijah. TSA je lahko uporabljn in vivo ter in vitro. Analize metiliranih in acetiliranih histonov so vključene v veliko raziskovanj epigenetskih procesov.

Pred kratkim odkrite epigenetske analize

• Širjenje kromatinskih sprememb v bioloških procesih vpliva na mnogo različnih genov v določenih regijah povzroči poglavitne spremembe v kromatinskem izražanju. Na primer: konci telomer vsakega kromosoma so obdani s heterokromatinom, širjenje heterokromatina ali pa translokacija gena ob telomeri lahko vodi do utišanja gena. Metode za pozicioniranje transgena ob na novo nastale telomere in analizo učinkov na delovanje transgena imajo številne aplikacije, ki bi bile uporabne v celičnem staranju, pri čemer se telomere skrajšajo za nek del z vsako celično delitvijo.
• Pojasnili so tudi vlogo ADP ribozilacije, kot modifikatorja histonov. Encim poli (ADP - riboza) polimeraza 1 (PARP - 1) dodaja poli (ADP - riboze) verige na proteine, kot so histoni H1, oktamerni histoni in transkripcijski faktorji. Analize ADP ribozilacije nam omogočajo lažje razumevanje vloge tega procesa (dodajanje poli (ADP - riboze) verig) v epigenetični kontroli izražanja genov in njegovih sprememb med staranjem celice, diferencijacijo celic in tudi pri tvorbi tumorjev.
• Še eno relativno novo področje v epigenetiki pa je kvantitativna epigenetika. To so tehnike ki združujejo teste ocenjevanje kvantitativne lastnosti lokusev z epigenetskimi analizami, ki omogočajo določanje položaja alelov posameznih genov in kromosomskih regij.

Analiza metilacije DNA

Obstaja zelo veliko raznličnih načinov za oceno DNA metilacije. Na začetku so DNA metilacijo določevali z izošizomerijo, ki deluje na principu restrikcijskih encimov. Encimi cepijo točno določeno regijo in sicer MspI cepi nemetilirane in metilirane CCGG zaporedja, HPAII pa cepi nemetilirane CCGG zaporedja. Problem metode je, da z njo lahko ocenimo le približno 5% metiliranih citozinov v DNA verigi.

Bisulfit metilacijsko sekveniranje

Bisulfit metilacijsko sekveniranje se je razvilo leta 1992, kar je močno pospešilo poznavanje in raziskovanje DNA metilacije. Prednost te metode pred prejšnjimi je v tem, da že z zelo malo genomske DNA dobimo izjemno natančne rezultate. Z bisulfitom( navadno uporabimo NaHSO3) modificiramo denaturirano DNA verigo, kjer se nemetilirani citozini pretvorijo v uracil. Metiliran citozin je z metilno skupino zaščiten pred deaminacijo z bisulfitom. S PCR-jem pomnožimo komplementarno verigo, kjer je nasproti novonastalega uracila namesto gvanina nastane timin. Nemetilirana in metilirana veriga imata zaradi različne sekvence različne lastnosti, kar se da analizirati z različnimi metodami. Metoda je boljša kot uporaba restrikcijskih encimov, saj se da določiti vse metilirane citozine na DNA fragmentu. Slaba stran te tehnike je, da je kljub mnogim izboljšavam še vedno relativno zahtevna za izvedbo. Po tem se je razvilo kar nekaj tehnik, ki so temeljile na disulfitnem metilacijskem sekevniranju.

• Metilacijsko občutljiva enoverižna konformacijska analiza (MS-SSCA) temelji bisulfitni obdelavi DNA, ki ji sledi PCR, kjer uporabimo prajmerje brez začetnih CpG dinukleotidov (da ločimo metilirano in nemetilirano verigo) in komplementarno deaminirano enoverižno DNA. Dele med seboj povežejo s polimerazo in analizirajo. Procent metilacije se izračuna iz intizitete metilirane in nemetilerane verige. Metoda je zelo razširjena, ker se jo da uporabljati na zamrznjenih tkivih ter celo na z formalinom fiksiranih vzorcih.
• V drugem primeru se uporablja prajmerski nukleotid (SNuPE). DNA veriga po dodatku NaHSO3 selektivno pretvori nemetiliran citozin v uracil. SNuPE-ju dodamo na 5' koncu ddTTP ali ddCTP. Metilirana ima na koncu nuklotid C, nemetilirana pa T. Produkt se nato obdela z eno izmed večih metod. Med drugim lahko uporabimo RT PCR, MALDI (matrix-assisted laser desorption ionization) masno spektrometrijo, ali pa ionsko-parni reverzno-fazni HPLC. Slednja je najprimernejša, saj je poceni, ter ne uporablja radioaktivnega označevanja. Metiliran kos verige se iz kromatografske koloni izloči pred nemetiliranim.
• Real-time polimeraza verige je reakcija, s katero se preizkuša občutljivost in točnost metiliranih alelov po obdelavi verige z disulfatom. Poveča se stopnja kontaminacije in točnost rezultatov.
• Metilirana in nemetilirana DNA imata različni talilni temperaturi (Tm), kar določamo z elektroforezo. Lastnost uporablajo tudi za izolacijo DNA fragmentov.
• Na novo se je razvila tehnika imenovana fotovezava oligonukleotidnih hibridizacijskih ostankov, s katero določimo rezistenco encima digeston na metilacijo.
• Z metilacijo specifičnih oligonukleotidov (MOS) pride do detekcije metilirane DNA verige preko CpG koncev. Kratko oligonukleotidno zaporedje z metiliranimi in nemetiliranimi aleli je pritrjena na trdno podlago. Po obdelavi z disulfatom nastane več produkta, ki se uporabi za hibridizacijo

Metilacijo DNA verige se uporabla tudi kot in situ hibridizacija. Na nedotaknjenem tkivu ali celičnem preparatu preučujejo utišanje gena zaradi metilaicije promotorske regije.

Analiza DNA metiltransferaz

Poleg tehnik za analizo metilirane DNA so napredovale tudi metode za preučevanje DNA metiltransferaz (DNMT). Ekspresija DNMT se spreminja v mnogih bioloških procesih, kot je embrionalni razvoj, rak ter staranje. Pri sesalcih poznamo 4 DNMTe: DNMT1, DNMT2, DNMT3a in DNMT3b. Za razumevanje DNA metilacije je potrebno poznati mehanizme za transkripcijo DNMTne mRNA. Raven transkripcije se meri z RT-PCR v realnem času. Pri tej metodi mRNA najprej obdelamo z reverzno transkriptazo, nato pa z PCR v realnem času. To je oblika PCR, kjer na koncu usakega PCR cikla analiziramo produkt s pomočjo flourescentnih markerjev, vezanih na PCR produkt. Na ta način zelo povečamo natančnost metode. Do nedavnega je bilo težko natančno izmeriti encimsko aktivnost DNA metiltransferaz, saj ni bilo dovolj natančnih metod. Klasični testi, ki uporabljajo steklena vlakna, ozr DEAE test, ki uporablja celulozni filter za filtracijo metiliranega substrata imajo en velik problem: ob močnem spiranju imamo šibko ozadje, a tudi šibek signal, ob šibkem spiranju pa imamo močan signal in močno ozadje. To je velik problem zaradi počasne hitrosti reakcij, ki jih katalizirajo DNMTe. Nekatere natančnejše tehnike pa so bile drage in počasne. Teh problemov je bilo konec z razvojem DMB (DNMT-magnetic beads) testom. Test temelji na afiniteti biotiniliranih sintetskih oligonukleotidov točno določene dolžine do z streptavidinom prevlečenih magnetnih kroglic. Tako lahko z magnetom fiksirajo kompleks magnetnih kroglic in oligonukleotidov, ter sperejo nereagiran, z tricijem označen substrat. To naredi ta test zelo preprost, hiter ter natančen.

Viri

• Voet D. in Voet, J. G. Biochemistry. 4. izdaja. Hoboken: J. Wiley & Sons, 2010
• Trygve O. Tollefsbol, Epigenetics Protocols, Humana Press, 2004
• Epigenetics, Wikipedia, april 2011, citirano 17.4.2011, http://en.wikipedia.org/wiki/Epigenetics