Prvi poskusi zdravljenja z RNAi

RNA interferenco so kot možen način zdravljenja preizkusili v začetku 21. stoletja. V nadaljevanju sta predstavljeni dve raziskavi, ki predstavljata uporabo RNA interference pri zdravljenju.

Fulminantni hepatitis

Fulminantni hepatitis je redka in pogosto usodna oblika akutnega hepatitisa, pri katerem se bolnikovo stanje hitro poslabša. Možni zapleti, ki se pri tem pojavijo, so jeterna encefalopatija, nekroza jetrnega tkiva, motnje strjevanja krvi, odpoved ledvic in koma.

Mehanizem s Fas povzročene apoptoze

S Fas povzročena apoptoza je lahko regulirana z različnimi signalnimi potmi v celicah in je potrebna za normalno celično delovanje. Ena od glavnih vlog Fas receptorja je regulacija imunskega odgovora in to je najbolj očitna značilna funkcija receptorja Fas, ki ga izraža veliko različnih celic. Fas ligand (FasL) je celična membranska molekula, ki se veže z receptorjem Fas in tako povzroči apoptozo celic, ki imajo na površini membrane receptor Fas. FasL večinoma izražajo aktivirani limfociti T in celice ubijalke. Aktivacija Fas receptorja s FasL povzroči kaspazno kaskado, ki se konča z apoptozo v občutljivih celicah. V s Fas povzročeni apoptozi je bistvena učinkovita formacija proteaznega kompleksa DISC (death-inducing signalling complex), sledi aktivacija kaspaze 8, ki direktno regulira formacijo velikih Fas receptorskih agregatov na plazemski membrani celic in povečano aktivnost DISC. Nazadnje se velik klaster Fas receptorjev endocitira in reciklira.

Poskusi s fulminantnim hepatitisom

Uvod in glavno vprašanje

Znano je bilo, da ima s Fas receptorjem povzročena apoptoza bistveno vlogo pri fluminantnem hepatitisu, zato so znanstveniki začeli iskati potencialne terapevtske tarče v poteh, saj bi tako lahko razvili različne terapije. Hepatocite so zelo dovzetne za s Fas povzročeno apoptozo, ker močno izražajo Fas. Posledično ima ta zelo pomembno vlogo pri poškodbah jeter zaradi različnih vzrokov, kot so: virusi, avtoimunost in zavrnitve zaradi presaditve. Glavno vprašanje znanstvenikov je bilo, ali lahko intravenozno siRNA injiciranje, katere tarča je Fas, zavre izražanje Fas v mišjih hepatocitah in vivo in zaščiti jetra pred fulminantnim hepatitisom in fibrozo.

Osnovni poskusi z siRNA

Znanstveniki so najprej delali raziskave s poskusi na treh skupinah miši. Prvi skupini (poskusnim) so vbrizgavali raztopino določene siRNA, kontrolnim (druga in tretja skupina) pa ali slanico ali pa GFP (green flurescent protein) siRNA po 8 in 24 urah po prvem injeciranju. Pri poskusnih miših so vbrizgavali raztopine siRNA sekvence 1, 2, 3, 4, 5 in 6. Tretiranje s Fas-1 siRNA je 8-10 krat znižalo Fas mRNA izražanje v primerjavi s slanico ali GFP siRNA vbrizganjem, kar so izmerili 24 ur po zadnjem vbrizganju. Dve dodatni siRNA-5 in siRNA-6 sta utišali izražanje za približno 81-86%, kar je približno enako učinkovito kot siRNA-1. Drugače je bilo pri siRNA-2, ki je ekspresijo znižala za le okrog 38%. siRNA-3 in siRNA-4 pa Fas izražanja sploh nista zavrli.
Nato so želeli določiti, ali uspešna supresija izražanja Fas v jetrih po injeciranju dupleksa siRNA zaščiti hepatocite pred s Fas povzročeno apoptozo. Zato so izolirane hepatocite iz miši tretiranih s Fas-1 siRNA in iz “slepo” injeciranih miši izzvali in vitro z agonističnim Fas specifičnim protitelesom (Jo2) ali z aktiviranimi hepatičnimi mononuklearnimi celicami, ki so jih pridobili iz s ConA (konkanavalin A) tretiranih miši. In vitro izpostavitev hepatocit iz slepo tretiranih miši Jo2 za 24 ur je pokazalo približno 87.8% apoptotskih celic v nasprotju z le 7.9% pri hepatocitah iz miši tretiranimi s Fas-1 siRNA. Še več, zaščita pred in vitro s Fas povzročeno apoptozo po intravenoznem injeciranju z ostalimi Fas siRNA sovpada s supresijo Fas: Fas siRNA, ki niso utišale izražanja, niso imele vpliva na apoptozo, medtem ko je delno utišanje zagotovilo delno zaščito.

Poskusi zmožnosti terapevtskega potenciala siRNA

Da bi ovrednotili še terapevtski potencial Fas siRNA za tretiranje kroničnih jetrnih poškodb, so znanstveniki odložili tretiranje s siRNA do 24 ur po drugi od šestih tedenskih injekcij z reducirano dozo ConA. Injeciranje siRNA so ponovili enkrat čez dva tedna. Miši so usmrtili po sedmih tednih, en teden po zadnji ConA injekciji. Vse “slepo” tretirane miši so razvile fibrozo v jetrnem tkivu, medtem ko niso opazili fibroze ali nekroze pri miših tretiranih s Fas-1 siRNA. Ti rezultati kažejo, da bi tretiranje s Fas siRNA morda lahko zagotovilo zaščito celo po začetku kroničnih poškodb jeter.
Da bi še dodatno ocenili, če Fas siRNA zagotovi daljše preživetje pri fulminantnem hepatitisu, so znanstveniki miši izzvali v še bolj agresivnem modelu hepatitisa, kjer so jim injecirali Fas specifična protitelesa intraperitonealno. Vse kontrolne miši so poginile v roku treh dni, večinoma 24 ur po injeciranju protiteles. Miši tretirane s Fas siRNA-2 ali siRNA-4, ki so utišale ekspresijo za 38% ali pa sploh ne, tudi niso bile zaščitene. Vendar pa so bile miši, ki so bile predtretirane s Fas siRNA, ki so ekspresijo utišale za 81-86% (siRNA-1, siRNA-5 ali siRNA-6), zaščitene pred letalnim izzivom: 33 od 40 miši je preživelo 10 dni. Dejansko so jetra in ostali organi preživelih miši izgledali normalno, ko so živali usmrtili po koncu daljšega opazovalnega obdobja. Torej Fas utišanje med akutnim izzivom prepreči smrt zaradi fulminantnega hepatitisa.

Sklep raziskav

Znanstveniki so zaključili, da bi bilo siRNA Fas utišanje lahko uporabno za preprečevanje in tretiranje akutnih in kroničnih poškodb jeter, ki jih povzročijo različni dejavniki, vendar pa bi bilo potrebnih še kar nekaj raziskav. Dodatno pa niso bili prepričani, če bi lahko injiciranje prilagodili primatom, saj injicirani volumen predstavlja znaten del krvnega volumna pri miših.

Starostna degeneracija rumene pege

Starostna degeneracija rumene pege je bolezensko stanje, pri katerem se bolniku vid poslabšuje zaradi sprememb v zgradbi mrežnice in žilnice. Spremembe so največkrat povezane s tvorbo novih krvnih žil v žilnici. Pri suhi različici degeneracije je slabšanje vida posledica propada vidnih čutnic. Zdravljenje ni možno, vendar bolezen napreduje počasneje. Mokra različica je hitro napredujoča oblika, pri kateri se v pod mrežnico razrastejo žile in povzročijo dvig ter nagubanje mrežnice. Zdravljenje je trenutno samo lasersko.

Osnove

Znano je, da igrata rastni faktor žilnega epitelija (vascular endothelial growth factor, VEGF) in njegov receptor (VEGFR) pomembno vlogo pri ožiljenju tkiv. VEGF je skupina rastnih faktorjev, ki imajo pomembno vlogo pri tvorbi novih žil, ki tkivom zagotavljajo oskrbo s kisikom. Pri degeneraciji rumene pege je VEGF A preveč izražen, zato razvoj žil poteka pospešeno. Za pravilno ožiljenje mrežnice sta potrebna dva receptorja, VEGF receptor 1 in VEGF receptor 2. VEGF receptor 1 nase veže ligande VEGF receptorja 2 in ga tako negativno regulira. Taka regulacija je nujno potrebna v razvoju zarodka, da ne pride do povečane tvorbe žil. Stimulacija VEGF receptorja 1 v kasnejših obdobjih lahko povzroči povečano izločanje nekaterih rastnih faktorjev iz žilnega epitelija, kar vodi v patološka stanja.

RNA interferenca kot potencialno zdravilo

siRNA in VEGF

Leta 2003 so zasnovali raziskavo, kjer so z uporabo RNA interference želeli ugotoviti, kako se VEGF odziva na interferenčno RNA (siRNA). V izbrani celični liniji (HeLa celice in "293" celice - ledvične celice človeškega zarodka) so s transfekcijo vnesli siRNA za človeški VEGF, kot kontrolo pa so uporabili sistem, kjer so VEGF-siRNA nadomestili z interferenčno RNA za zeleni fluorescentni protein (EGFP-siRNA). Po enem dnevu so v celicah vzbudili hipoksično stanje (stanje, kjer primanjkuje kisika) ter tako izzvali povečano izražanje VEGF genov. Dokazali so, da je siRNA, specifična za VEGF mRNA, občutno zmanjšala koncentracijo produkta. V kontrolnih celicah ni bilo opaznega inhibitornega učinka. Ker so z in vitro poskusi dokazali, da je metoda učinkovita, so v naslednji stopnji izvedli poskuse in vivo.
Najprej so preverili, če je možno siRNA učinkovito dozirati v epitelijske celice mrežnice. Pri tem so uporabili miške in sistem EGFP/EGFP-siRNA. Vnos so izvedli z injekcijami v subretinalno področje (področje pod mrežnico). Rezultati so bili analizirani s pregledom očesnega ozadja in histološkimi rezinami.
Doslej uporabljeni VEGF je bil človeški, zato jih je zanimalo tudi, ali je učinkovitost siRNA enaka pri mišjem VEGF. Dokazali so, da je metoda primerna za zdravljenje degeneracije rumene pege v miših.

siRNA in VEGF 1 receptor

Tudi tukaj so se najprej lotili poskusov na celicah. Uporabljena siRNA ima takšno zaporedje, da je tarčno mesto ohranjeno tako pri človeku kot tudi pri miših in podganah. Uspešnost delovanja siRNA so preverjali z luciferaznim reporterskim sistemom in dokazali učinkovitost siRNA že pri 50 pM (50x10^-12 M).
Znotraj raziskave so ugotavljali tudi porazdelitev siRNA v plasteh mrežnice. Do 24 ur po injiciranju je bila siRNA prisotna v plasti ganglijskih celic (GCL, ganglion cell layer) in v plasti notranjih jeder (INL, inner nuclear layer). Po 48 urah je bila siRNA prisotna v plasti zunanjih jeder (ONL, outer nuclear layer) ter v fotoreceptorskih celicah. Po petih dneh siRNA v očesu niso več zaznali.
Tudi tukaj so uspešno znižali koncentracijo mRNA za VEGF receptor v celicah. Poudarjajo pa, da enkratno injiciranje ni dovolj in je potrebno za uspešno zdravljenje postopek večkrat ponoviti.

Rezultat

Farmacevtska družba Acuity Pharmaceuticals je na podlagi raziskav razvila zdravilo Bevasiranib, ki so ga že klinično preizkusili, vendar niso dobili dovoljenja za rutinsko uporabo.

Viri

• E. Song et al. RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis. Nature medicine, 2003, letnik 9, str. 347-351
• T. Cotter in J. Curtun. Live and let die: regulatory mechanisms in Fas-mediated apoptosis. Cellular Signalling, 2003, letnik 15, str. 983-992
• S. Reich et al. Small interfering RNA (siRNA) targeting VEGF effectively inhibits ocular neovascularization in a mouse model. Molecular vision, 2003, letnik 9, str. 210-216
• J. Shen et al. Suppression of ocular neovascularization with siRNA targeting VEGF receptor 1. Gene therapy, 2006, letnik 13, str. 225-234.