Mikrobicidno delovanje α in θ defenzinov na antibiotik-odporne Staphylococcus aureus in Pseudomonas aeruginosa

UVOD

Bakterije odporne na antibiotike predstavljajo tako zdravstveni kot tudi ekonomski problem. Številni antibiotiki ciljajo na specifične bakterijske encime ali reakcije in lahko se zgodi, da geni odgovorni zanje mutirajo pod vplivom selekcijskega pritiska kar lahko pripelje do odpornosti na antibiotike. Velik potencial v boji proti patogenim bakterijam kažejo protimikrobne snovi, ki vplivajo na integriteto celične membrane. To so sesalski α in θ defenzini, kationski peptidi s specifičnmi tridisulfidnimi mrežami. Alfa defenzini se večinoma nahajajo v neutrofilnih azurofilnih granulah, najdemo jih tudi v naravnih celicah ubijalkah. θ defenzine pa so zaenkrat odkrili le v kostnem mozgu nekaterih primatov. Defenzini delujejo tako, da se selektivno vežejo na bakterijske membrane in povzročijo izhajanje kalijevih ionov in hranil, depolarizacijo membrane in posledično celično smrt. Da potrdijo hipoteze o njihovem baktericidnem delovanju, so preverili učinek α defenzinov (Crp-4, RMAD-4, HNP 1-3) in θ defenzinov (RTD 1) na meticilin odporno Staphylococcus aureus (MRSA), skupaj z vankomicin rezistentnimi sevi in na ciprofloksacin odporne Pseudomonas aeruginosa (PA).

MATERIALI IN METODE

Peptide so homogenizirali z reverzno-faznim HPLC in karakterizirali z MALDI-TOF MS in AU-PAGE. Rekombinantne Crp - 4 in RMAD -4 peptide so izrazili v bakteriji Escherichia coli kot N- terminalni fuzijski protein s His6 oznako preko pET28a ekspresijskega vektorja. Sledila je izolacija s His6 označenih fuzijskih Crp- 4 peptidov z afinitetno kromatografijo z uporabo nikelj-nitrilotriocetno kislino. Cianogen bromid je služil za odstranitev His6 fuzije, proteine pa so prečistili s sekvenčnim C18 Rp-HPLC in določili molekulsko maso z MALDI-TOF MS. Natančna določitev strukture je bila opravljena z metodo NMR. HNP so izolirali iz vzorcev obogatenih z nevtrofilnimi granulami pripravljenimi iz perifernih levkocitov. HNP 1-3 so pridobili z gelsko permeacijsko kromatografijo z uporabo BioGel P10, HNP 2 so očistili iz druženih HNP 1-3 z metodo C18 RP-HPLC. Θ defenzin RTD-1 pa so sintetizirali. Klinične izolate so pridobili iz hospitaliziranih pacientov. MRSA izolate odporne na vankomicin so določili z uporabo Etest glikopeptid rezistentne detekcijske metode. PA dovzetnost na ciproflokasin pa so določili z mikrodilucijsko metodo. Ciprofloksacinska odpornost je bila definirana z minimalno inhibitorno koncentracijo 2μg/ml ali več. MRSA in PA seve, ki povzročajo pljučnico, bakteriemijo, infekcije ran in urinarnega trakta so izbrali kot reprezentativne klinične izolate z različnimi stopnjami odpornosti na vankomicin (MRSA) in ciprofloksacin (PA). Alfa in θ defenzine so testirali na baktericidno aktivnost pri kliničnih izolatih MRSA in PA v in vitro celičnih suspenizijskih testih. Preživetje bakterij glede na izpostavitev peptidom so določili z štetjem CFU. 1h po izpostavitvi peptidom so peptidne in bakterijske mešanice nagojili na agarne plošče.

REZULTATI

Crp-4, RMAD-4 in RTD–1, testirani s kliničnimi izolati MRSA z različnimi stopnjami odpornosti na vankomicin, na podoben način zmanjšajo viabilnost sevov, ne glede na vankomicinsko rezistenco izolatov. Enako so storili tudi s sevi PA odporne na ciprofloksacin, ki so jih testirali s Crp-4, RMAD-4, RTD-1 in HNP 1-3 ter določali učinkovitost glede na različne odpornosti na ciprofloksacin, mesta izolacije,TTSS efektorskega genotipa in citotoksični potencial. Ugotovili so, da je Crp-4 bolj učinkovit pri PA izolatih, RMAD-4 pa pri izolatih MRSA. Pri sevih pridobljenih iz različnih mest (opekline, urin, kri), ki se med seboj tudi fenotipsko razlikujejo, sta Crp-4 in RMAD-4 delovala z enako občutljivostjo. Sicer so pri RMAD-4 opazili večjo aktivnosti pri sevih izoliranih iz opeklin, kar nakazuje na morebitno povezavo med mestom izolacije PA in odpornostjo na α defenzine. Rezultati so pokazali,da HNP1-3 in HNP-2 nimajo velikega vpliva na preživetje PA, napredek niso opazili niti pri koncetracijah pri katerih sicer Crp-4 in RTD-1 delujeta močno baktericidno. Tudi kationski naboj vpliva na baktericidno delovanje defenzinov. Tako je na primer Crp-4 veliko bolj učinkovit proti PA, RMAD pa proti MRSA izolatom. Verjetno gre tu za vpliv različnih porazdelitev površinskih nabojev ali hidrofobnosti.

ZAKLJUČKI

Protimikrobni peptidi predstavljajo dobro platformo za razvoj novih terapevtikov proti odpornim patogenom. Defenzini vplivajo na celično integriteto, vplivajo na delovanje membrane in se po mehanizmu razlikujejo od beta laktamskih inhibitorjev in vankomicina. Defenzine bi tako lahko združili z obstoječimi antibiotiki in tako izboljšali njihovo delovanje ter posledično povečali učinkovitost zdravljenja proti odpornim patogenom.