Popravljanje DNA v kontekstu kromatina

Ob poškodbi dednega materiala se celica odzove s t.i. DDR (DNA damage response, glej Figure 2), ki poleg direktnega popravila napake vključuje tudi upočasnitev celičnega cikla, kar celici zagotovi več časa za popravljanje. Slednje je neizogibno povezano s konformacijo DNA, saj je ta večino časa v celici tesno zvita v strukturo, imenovano kromatin, kar vzpostavljajo proteini histoni. Prav kromatinsko stanje, ki tako kot na replikacijo ali transkripcijo vpliva tudi na DDR, je tisto, ki določa in omogoča dostop ključnim popravljalnim proteinom. Ključno za razumevanje popravljanja DNA v kontekstu kromatina je poznavanje celičnega cikla in popravljalnih mehanizmov.

Celični cikel, NER in DSB

Celični cikel

Celični cikel sestavljajo štiri faze: faza G1, S, G2 in M. V času faze G1 celica raste in ko doseže prvo kontrolno točko, ob prehodu v fazo S, mora biti podvojena določena minimalna količina RNA, proteinov, lipidov ter ogljikovih hidratov, DNA pa ne sme biti poškodovana. V primeru, da je DNA poškodovana, celica preide v fazo G0, kjer pride do popravljanja ali morebitne apoptoze. V fazi S in G2 pride do replikacije DNA in na kontrolni točki med G2 in M mora biti vsa DNA podvojena, nepoškodovana, ključno pa je tudi spodbudno zunajcelično okolje. Celični cikel uravnavajo proteini ciklini in od ciklinov odvisne kinaze, katerih delovanje je močno povezano s kromatinskim statusom DNA.

NER in DSB

Eden izmed najbolj znanih tipov popravila DNA pri sesalcih, odvisen od preoblikovanja kromatina, je popravljanje z izrezom nukleotidov (NER - nucleotide excision repair). Mehanizem NER popravi posledice večine enojnih prelomov DNA, ki jih zazna zaostajanje RNA polimeraze II oziroma vezava kompleksa UV-DBB (UV-damaged DNA binding protein) oz. kompleksa XPC (xeroderma pigmentosum group C). Napačen nukleotid se izreže s pomočjo NER faktorjev, helikaz (XPB, XPD), proteinov SSB (XPA, RPA) in endonukleaz (XPF-ERCC1, XPG). Vrzel se zapolni s sintezo pravilne DNA glede na neokvarjeno matrično komplementarno verigo. Ta korak je izveden s pomočjo replikacijskega kompleksa in DNA ligaze.

Prav tako je dostopnost kromatina pomembna pri popravljanju dvojnih prelomov DNA (DSB - double strand breaks), kjer sta poškodovani obe verigi. Popravljanje DSB poteka preko nehomolognega povezovanja koncev (takojšnja povezava prelomljenih koncev DNA) ali pa s homologno rekombinacijo, ki lahko poteče izključno med S in G2 fazami celičnega cikla .

Kovalentne modifikacije histonov

Najprej mora priti do zaznave in določitve poškodbe, pri čemer pomaga tudi kromatinski status DNA. Direktna vezava popravljalnih proteinov je namreč pogosto onemogočena, saj so lahko poškodovane regije skrite in zakopane globoko v nukleosomskem jedru. Kovalentne modifikacije, ki omogočijo dostop popravljalnim proteinom, tako vzpostavljajo dinamično ravnotežje, ključno za stabilnost genoma.

Fosforilacija

---

Fosforilacija serina 139

Ob dvojnem prelomu DNA, poteče fosforilacija (glej Figure 2) serina 139 na histonu H2AX. Reakcija je hitra, zgodi se blizu poškodovane regije in katalizirajo jo fosfoinositid-3-kinazi podobna kinaza (PIKK) ATM ter DNA-protein kinaze. Fosforiliran histon, γ-H2AX, je potreben za formacijo IRIF (ionizig radiation induced foci). Gre za kromosomsko mikrookolje, ki spodbuja vezavo popravljalnih proteinov, kot so NBS1 in Brca1 ter proteinov kontrolnih točk celičnega cikla, MDC1 in 53BP1. Koncentriranje slednjih tako spodbuja popravljanje, zmanjšuje možnosti mutacij in hkrati služi kot ojačevalec signalov kontrolnih točk celičnega cikla.

(De)fosforilacija tirozina 142

V običajnih situacijah je fosforiliran tudi tirozin 142 histona H2AX. Defosforilacijo sprožijo rentgenski žarki s poškodbo DNA, čemur sledi fosforilacija serina 139 ter vezava popravljalnih faktorjev. V primeru, da ne pride do defosforilacije tirozina, se na H2AX veže protein kinaza JNK1, kar sproži apoptozo. (De)fosforilacija tirozina je torej signal celici, da ob poškodbi presodi ali je zmožna popravila ali pa se usmeri v apoptozo.

Preučevanje fosforilacije ob DSB v kvasovkah

Vpliv fosforilacije ob nastanku DSB je bil preučevan tudi na kvasovkah, ki vsebujejo galaktozno-inducibilno HO endonukleazo. Ta sproži dvojni prelom na mestu MAT (active mating type locus), ko celice rastejo v prisotnosti galaktoze. Sledi mu fosforilacija histona H2AX (značilni motiv slednjega se pojavi na C terminalnem repu, t.i. motiv SQEL/Y) na serinu 129, ki jo katalizirajo kinaze Mec1/Tel1 (homologi sesalskim ATR/ATM kinazam). Nastali γ-H2AX ostane prisoten skozi celoten mehanizem popravljanja poškodbe .

Acetilacija

---

Acetilacija histonov lahko poteče zaradi sevanja UV žarkov in s tem vzpostavi odprto, aktivnejšo kromatinsko strukturo, ki je dostopnejša in omogoča vezavo popravljalnih proteinov. Acetilirana je kombinacija lizinskih ostankov na N terminalnih repkih histonov H3 in H4, kar nevtralizira sicer pozitivni naboj in s tem zrahlja interakcijo med histoni in DNA. Ključna katalizatorja sta histonski acetiltransferazi p300 in Gcn5.

Metilacija

---

Metilacije potečejo na lizinskih in argininskih ostankih, katalizirajo jih histonske metiltransferaze. Histoni so lahko mono-, di- ali trimetilirani, specifično zaporedje metiliranih aminokislinskih ostankov pa naj bi določalo transkripcijsko aktivnost in s tem dostopnost kromatina tako transkripcijskim kot tudi popravljalnim proteinom. Direktne povezave med metilacijami in popravljalnimi mehanizmi sicer niso znane, sta pa bili v primeru poškodb zaradi UV žarkov najdeni metilaciji H3K79me in H4K20me.

Ubikvitinacija

---

Vezava ubikvitina, majhnega peptida, ni nujno znak za proteasomsko razgradnjo proteina, ampak je lahko posledica sevanja UV žarkov ali DSB. Ubikvitinacija tako lahko povzroči sproščeno interakcijo med histoni in DNA, kar omogoči vezavo popravljalnih proteinov. Ob poškodbi zaradi UV žarkov pri kvasovkah poteče ubikvitinacija na lizinu 123, na histonu H2B. Katalizira jo kompleks Rad6/Bre1 E2/E3.

Pri sesalcih pride zaradi UV žarkov do ubikvitinacije histona H2A, ki pa naj bi bila bolj posledica NER kot pa povod, saj so nekateri eksperimenti pokazali, da v vseh celicah ni prišlo do modifikacije tega histona ob izpostavitvi UV sevanju. Prav tako se ob prisotnosti kompleksov UV-DDB in CUL4A začasno ubikvitinirata histona H3 in H4, kar ustvari kromatinsko okolje, ki omogoči NER.

Histona H2A in H2AX naj bi bila ubikvitinirana tudi ob dvojnih prelomih, kar katalizirata encima Ubc13 (encim E2) in RNF8 (E3-ligase RING finger-containing enzyme RNF8). Ubikvitinacija naj bi potekla zaradi fosforilacije histona H2AX in posledične aktivacije proteina MDC1, kamor se veže RNF8. Kljub temu, da direktno kavzalno sosledje med ubikvitinacijo in popravljalnimi mehanizmi ni dokazano, je eksperimentalno delo pokazalo, da v primeru deubikvitinacije pride do zaostanka poteka faze S in aktivacije kontrolnih točk celičnega cikla.

Od ATP odvisno preoblikovanje kromatina

Energija hidrolize ATP se porablja pri zamenjavi ali odstranitvi histonov ter pri premikanju nukleosomov vzdolž DNA. Kromatin-preoblikovalni kompleksi s hidrolizo ATP vplivajo na dostopnost DNA za transkripcijo, translacijo in popravljanje DNA. Kompleksi vsebujejo encime iz štirih različnih družin z motorno ATPazno (SNF2-like) podenoto: družina SWI/SNF, družina ISWI, družina NuRD/Mi-2/CHD (nucleosome remodeling and deacatylation / chromodomain, helicase binding) in družina INO80 (inositol requiring 80). Prvi dve družini sta opaženo stimulirali NER.

Družina SWI/SNF (switching defective/sucrose fermenting)

Encimi te družine v in vitro pogojih spreminjajo dostopnost nukleosomov ob poškodbah zaradi UV žarkov. Eden od teh DNA popravljalnih proteinov je protein Cockaynovega sindroma skupine B (CSB), ki in vitro spreminja razporeditev nukleosomov v odvisnosti od ATP. Poleg tega privabi p300/CBP in HMGN1 ter interagira s histoni in DNA. Kvasni homolog CSB je Rad26.

Družina ISWI (imitation SWI)

Običajno je ta družina vključena v regulacijo transkripcije. Večina transkripcijo stimulira, z izjemo ACF (od ATP odvisni kromatin-povezovalni in preoblikovalni faktor), ki jo zavira. V kvasovkah ACF premika nukleosome brez odstranjevanja histonov in izboljša NER, sploh na povezovalnih regijah med nukleosomi. NER faktorjem (XPC, XPA, RPA) je olajšan izrez 6-4PP lezij.

Nekromatinski preoblikovalci

Nekateri nekromatinski proteini lahko spreminjajo kromatin ali se vežejo na modificirane histone. GADD45 se preferenčno veže na hiperacetilirano DNA, ki so jo poškodovali UV žarki, in spremeni dostopnost nukleosomov. Sledi popravilo lezij, ki jih povzroča UV svetloba, z izrezom nukleotidov (NER). Nukleosom vezavni proteini HMGN (high mobility group N) se s posredovanjem CSB vežejo na rastoči popravljalni kompleks na poškodovani DNA in spremenijo kromatinske strukture s tarčenjem histonov H1 in H3. Manj HMGN1 v celici zmanjša frekvenco popravil.

Vrnitev v originalni kromatinski status

Po popravilu dvojnega zloma se kromatin prestrukturira v prvotno epigenetsko stanje. V tej stopnji sodelujejo histonske deacetilaze (HDAC), ki odstranijo acetilne markerje. Nekatere od njih so na zlomu prisotne že med popravilom mutacije .

Bolj kot deacetilaze so ključni od ATP neodvisni histonski šaperoni, kot so CAF1 (kromatinski povezovalni faktor 1), ki je sestavljen iz podenot p150, p60 in p48 ter močno ohranjen pri evkariontih. Njegova naloga je namestiti nukleosome na novo prepisani DNA med replikacijo ali na pravkar popravljeno DNA po NER. Znano je, da so med popravilom UV-povzročenih lezij (fotolezij) priključeni histoni H3 in H4. Analogno do sedaj še niso bili opaženi H2A/H2B histonski šaperoni v povezavi z NER, a bi bil možen kandidat šaperon FACT zaradi podobne vloge kot H3/H4 šaperon CAF1 med replikacijo in transkripcijo. CAF1 se veže na DNA v odvisnosti od NER. Dodajanje histona H3.1 na popravljeno, do nedavnega zaradi UV poškodovano, mesto se zgodi šele po NER in s pomočjo CAF1. Slednji se pojavi na poškodovanem mestu šele po prihodu vseh endonukleaznih encimov in po zaključeni ligaciji. Rez na mestu 5' sproži sintezo novega segmenta DNA in hkrati privabi CAF1.

CAF1 poveča uspeh vračanja premeščenih nukleosomov s sodelovanjem s ASF1 – močno ohranjenim histonskim šaperonom, s katerim vmešča H3/H4 dimere in tetramere. ASF1-CAF1 sta aktivna med replikacijo in UV induciranih poškodbah DNA. Pri izbitju enega od genov cac1 (gen za CAF1) in asf1 je še vedno prisotna premeščevalna aktivnost, vendar s slabšim izkoristkom. CAF1 in ASF1 sta torej v osnovah samozadostna.

Viri

1. C. Dinant, A. B. Houtsmuller, and W. Vermeulen, “Chromatin structure and DNA damage repair.,” Epigenetics Chromatin, vol. 1, no. 1, p. 9, 2008.
2. J. E. Krebs, B. Lewin, E. S. Goldstein, and S. T. Kilpatrick, Lewin’s Essential Genes. Jones and Bartlett Publishers, 2013.
3. Cook,P.J., Ju,B.G., Telese,F., Wang,X., Glass, C.K., and Rosenfeld,M.G. (2009). Tyrosine dephosphorylation of H2AX modulates apoptosis and survival decisions. Nature 458, 591-596.
4. N. C. M. House, M. R. Koch, and C. H. Freudenreich, “Chromatin modifications and DNA repair: Beyond double-strand breaks,” Front. Genet., 2014.