Senzor za detekcijo spolno prenosljivih okužb

Francoska skupina iz INSA LYON univerze je v svojem projektu izdelala diagnostični senzor za detekcijo okužb s spolnimi boleznimi.

INSA-LYON iGEM 2016 - Detect'Em All [1]

UVOD

Na leto se po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije s spolno prenosljivimi okužbami okuži okrog 125 milijonov ljudi. Dejansko število okuženih pa je še bistveno večje. Medtem, ko je raziskav na tem področju ogromno, je testov za samostojno uporabo na trgu relativno malo, te so pa večinoma dragi in zahtevni za uporabo. Skupina iz Lyona je tako dobila idejo o izdelavi enostavnega, hitrega, poceni in uporabniku prijaznega senzorja za detekcijo dveh pogosto smrtih spolno prenosljivih okužb. Detect'Em All je diagnostični test za zgodnje odkrivanje okužb z HIV in hepatitisom B (HBV). Test temelji na analizi kapljice krvi, ki jo pridobimo iz prsta in se lahko uporabi 15 dni po morebitni okužbi.

Test za diagnozo HIV-a temelji na zaznavi encima reverzne transkriptaze, ki je v telesu prisoten 14 dni po okužbi z virusom. Za diagnozo okužbe z virusom hepatitisa B pa test temelji na zaznavi antigena HBsAg (angl. hepatitis B virus surface antigen), ki se nahaja na površini virusa. Sistem temelji na detekciji interakcije med specifičnim aptamerom in tarčnim proteinom. Za detekcijo rezultatov testa so uporabili kroglice iz lateksa. Sistem so pritrdili na papir preko fuzijskega proteina.

Komplet za testiranje vsebuje: testno napravo, pufer, alkoholno blazinico in obliž. Naprava za testiranje vsebuje skrito iglo, s pomočjo katere iz prsta pridobimo kapljico krvi, ki jo kapnemo v za to namenjano odprtino. Nato dodamo par kapljic priloženega pufra, kar omogoči difuzijo vzorca ter počakamo 15 minut na rezultate. Na vsakem lističu za detekcijo se pojavita dve lisi; kontrolna lisa, ki služi za detekcijo migracije vzorca ter testna lisa. Kompletu za testiranje so priložili tudi alkoholno blazinico in obliž za oskrbo prsta iz katerega smo pridobili vzorčno kri.

PROJEKT

Osnova za delovanje testa

Za detekcijo tarč so uporabili aptamere. Uporaba aptamerov v primerjavi s protitelesi je cenovno bolj ugodna. Aptameri so majhne enovijačne DNA molekule. Večinoma se jih uporablja kot terapevtike, saj lahko delujejo kot inhibitorji encimov ter v diagnostiki, kjer služijo kot alternativa protitelesom. Tarče so lahko makromolekule, kot so proteini ali manjše molekule kot npr. ATP. Francoska skupina se je odločila za uporabo štirih različnih vrst aptamerov:

• Adenozinski aptamer: veže se na adenozinske derivate, kot so ATP, AMP. Ta aptamer so uporabili kot enega izmed kontrolnih aptamerov, s katerimi so potrdili princip delovanja testa.

• Trombinski aptameri: testirali so tri različne aptamere proti trombinu. Trombin je najbolj raziskana tarča aptamerov, zato so ga izbrali za dokaz delovanja njihove ideje. Vse raziskave so predhodno testirali na trombinu, šele po dobljenih želenih rezultatih so testiranja ponovili še z HIV in HBV tarčami.

• HIV-1 reverzno transkriptazni (RT) aptamer: veže se na po krvi cirukulajočo HIV-1 reverzno transkriptazo.

• HbsAg aptameri: vežejo se na antigen ki se nahaja na površini virusa hepatitisa B. Testirali so afiniteto treh različnih aptamerov proti HbsAg antigenu.

Za določevanje afinitete in selektivnosti aptamerov so uporabljali fluorescenčno detekcijo in EMSA tehniko, kjer kompleks med tarčo in aptamerom potuje počasneje na gelu, kot prosta DNA.

Detekcija rezultatov

• S fluorescenco

Začetna ideja je temeljila na zaznavi rezultatov testa s pomočjo fluorescence. Aptamer so vezali na fluoriscirajočo skupino (FITC - fluorescein izotiocianat). Želeli so da FITC oddaja fluorescenco le, ko je na aptamer vezana tarča, v odsotnosti tarče pa fluorecence ne opazimo. Za ta namen so uporabili dušilec fluorescence (ang. »quencher«), ki absorbira emitirano energijo fluorofora in jo nato odda v obliki toplote. Kot dušilec so uporabili molekulo DABCYL, ki so jo vezali na 3' konec oligonukleotida, dolgega 6 nukleotidov z zaporedjem komplementarnim zaporedju aptamera. Ko pride v bližino aptamera z vezanim komplementarnim oligonukleotidom, tarča, se ta zaradi večje afinitete veže na aptamer in izpodrine vezan oligonukleotid z dušilcem in takrat opazimo fluorescenco. Želeli so, da bi fluorescenco lahko zaznal vsak uporabnik testa doma, to bi dosegli z uporabo različni filtrov na pametnih telefonih. Dokazali so da sistem deluje, aptamer je prepoznal tarčo in oddajal fluorescenco, a signal je bil prešibak za zaznavo s prostim očesom ali z uporabo pametnih telefonom, opremljenih z ustreznimi filtri.

• Z lateksovimi kroglicami

Glede na to, da se je detekcija rezultatov s fluorescenco izkazala kot neučinkovita za domačo uporabo, je skupina našla drugačno rešitev problema. Uporabili so črne, s prostim očesom vidne kroglice iz lateksa, na katere so pripeli aptamer. Ta način detekcije je zahteval uporabo dveh različnih aptamerov, ki vežeta tarčo. Na prvi aptamer so vezali kroglico iz lateksa, medtem ko so drugi aptamer pritrdili na papirno podlago. Po nanosu vzorca krvi, se tarča v krvi veže na kompleks aptamera in kroglice, nato celoten kompleks potuje naprej do drugega aptamera, ki je pritrjen na nitrocelulozno podlago, kompleks se tako veže na pritrjen aptamer in takrat zaznamo na papirju črno liso, ki nam poda pozitiven rezultat diagnostičnega testa in potrdi okužbo uporabnika s spolno boleznijo. Aptameri s kroglicami, ki se niso uspeli vezati na tarčo potujejo naprej po podlagi in se vežejo na kratke oligonukleotide, ki so pritrjeni na koncu papirnega traku in imajo zaporedje, ki je komplementarno zaporedju aptamera vezanega na kroglice. Komplementarni oligonukleotidi služijo za kontrolo pravilne migracije vzorca.

Pritrditev sistema na papir

Uporabili so nitrocelulozne trakove, ki vsebujejo filtracijsko blazinico iz steklenih vlaken, nitrocelulozni del in adsorbcijsko blazinico. Filtracijska blazinica služi za filtracijo krvi, za odstranjevanje eritrocitov, kajti rdeča barva oteži pravilno interpretacijo rezultatov.

Za vezavo sistema na celulozno podlago so testirali dva modificirana proteina: streptavidin z vezano celulozno vezavno domeno (CBD, ang. cellulose binding domain). Za izražanje takega fuzijskega proteina so uporabili že obstoječo biokocko, ki jo je naredila ekipa Stanford-Brown-Spelman leta 2014 na iGemu. Testirali so tudi svojo, spremenjeno različico fuzijskega proteina, kje so na streptavidin poleg celulozno vezavne domene pripeli še protein CiPA (ang- cellulosomal scaffolding protein A).

Afiniteto obeh modificiranih proteinov do celuloze so preverjali z merjenjem fluorescence. Na 5' konec DNA oligonukleotida so vezali fluorescein in na 3' konec DNA biotin, sledila je inkubacija z obema modificiranima streptavidinoma ter za primerjavo še inkubacija z komercialno dostopnim streptavidinom. To so nadalje inkubirali s celulozo, sprali in izmerili fluorescenco.

Ugotovili so, da se majhen delež komercialno dostopnega streptavidina spontano veže na celulozo, oba modificirana streptavidina se z visoko afiniteto vežeta na celulozo, s tem da jim je uspelo z dodatkom CiPA domene še izboljšati vezavnost na celulozo.

Ogrodje naprave

Naprava je sestavljena iz dveh delov, plastičnega ogrodja ter štirih papirnih lističev, dva lističa služita za kontrolo (detekcija ATP in trombina iz krvi) medtem ko druga dva služita za detekcijo morebitne okužbe s HIV ali hepatitisom B. Ogrodje naprave so natisnili s 3D tiskalnikom. Želeli so izdelati uporabniku čim bolj prijazno napravo, zato so se odločili za polkrožno ogrodje iz PLA (poliaktida oz. polimlečne plastike), ki je biološkega izvora in je popolnoma razgradljiva, kar omogoča reciklažo že uporabljenih senzorjev.

Problemi

Skupini projekta ni uspelo pripeljati do konca, problemi so se pojavili pri testiranju sistema na papirju. Kroglice iz lateksa niso mogle dovolj hitro potovati po nitrocelulozni podlagi. Naročili so nitrocelulozne lističe z večjimi porami, ki bi omogočale lažje potovanje vzorca po lističu, vendar naročeni trakovi niso prispeli dovolj zgodaj za testiranje.

Skupina bi prav tako morala poiskati še en dodaten aptamer, ki bi vezal reverzno transkriptazo virusa HIV, za način detekcije z kroglicami iz lateksa je namreč potrebna uporaba dveh različnih aptamerov.

ZAKLJUČEK

Cilj skupine je bil izdelati učinkovit, enostaven, hiter in cenovno ugoden diagnostični test za samostojno uporabo. Sama izvedba testa nam vzame 2 minuti, rezultati pa so vidni po 15 minutah. Cena takega senzorja bi znašala 10 evrov. Skupini projekta ni uspelo pripeljati do konca zaradi pomanjkanja časa, vendar s projektom mislijo nadaljevati in ga nekega dne predstaviti na trgu.

Na sintezno biološkem tekmovanju iGEM leta 2016 so za predstavljeni izdelek prejeli zlato nagrado za najboljši diagnostični projekt.

VIRI LITERATURE

http://2016.igem.org/Team:INSA-Lyon (sneto 6.1.2017)

https://en.wikipedia.org/wiki/Sexually_transmitted_infection (sneto: 8.1.2016)