Metabolni inženiring termofilne filamentozne glive Myceliophthora thermophila za proizvodnjo fumarne kisline

1 Uvod

Fumarna kislina je pomembna organska kislina, ki se pogosto uporablja v prehranski industriji, v medicini ter pri proizvodnji umetnih smol in biorazgradljivih polimerov. Primarna surovina za proizvodnjo fumarne kisline je nafta, zato se je v zadnjem času, zaradi vse večjih energijskih in okoljskih problemov močno povečalo zanimanje za alternativne načine proizvodnje, predvsem s pomočjo mikrobne fermentacije. Pri tem ima pomembno vlogo metabolni inženiring, s pomočjo katerga lahko razvijemo mikrobne seve z izboljšanimi sposobnostimi proizvodnje. Filamentozne glive se pogosto uporabljajo za proizvodnjo različnih organskih kislin, vendar se je do sedaj le majhno število študij osredotočilo na metabolni inženiring filamentoznih gliv za proizvodnjo fumarne kisline. [1,3]

2 Gliva M. thermophila

Raziskovalci so se za namen študije odločili uporabit glivo M.termophila. Ta spada med termofilne (njen temperaturni optimum je med 45°-50°C), filamentozne glive iz družine Chaetomiaceae. Ker je v njenem temperaturnem območju na voljo malo raztopljenega ogljika, se je ta vrsta gliv prilagodila na uporabo netopnih oblik ogljika (celuloza, hemiceluloza) kot vira energije. Sekvenciranje njenega genoma je pokazalo, da ta vsebuje zapis za številne termostabilne encime, ki bi lahko imeli pomembno industrijsko uporabo. Tak primer so npr. celulaze, ki jih sintetizira M.thermophila in bi lahko imele pomembno vlogo pri proizvodnji biogoriv. Do sedaj so z uporabo te glive (sev C1) že razvili sistem, za proizvodnjo hidrolaz na industrijskem nivoju. Ta sev je leta 2009 dobil oznako GRAS, kar prav tako predstavlja določene prednosti v primerjavi z nekaterimi sevi iz drugih gliv, ki se trenutno uporabljajo v industrijske namene. Poleg celulaz, M.thermophila izraža še številne druge pomembne encime, kot so npr. fitaze in lakaze.[1,2]

3 Metabolni inženiring

Raziskovalci so v študiji preučevali ter optimizirali biosintezno sposobnost M.thermophila za proizvodnjo fumarata s pomočjo različnih tehnik ter po stopnjah uvajali spremembe v metabolizem, ki ga gliva uporablja za proizvodnjo fumarata. [1]

3.1 Uvedba C4-dikarboksilatnega transporterja

Predhodne študije so pokazale, da prekomerno izražanje karboksilatnega transporterja vodi do izboljšane sinteze organskih kislin. S tem namenom so v divji tip glive uvedli zapis za gen Spmae, ki zapisuje za C4-dikarboksilatni transporter pri S.pombe in je predhodno že bil uporabljen za proizvodnjo malata, fumarne kisline in sukcinata.[1]

3.2 Prekomerno izražanje fumaraze

Študije so pokazale, da je ena izmed ključnih omejitev pri proizvodnji fumarne kisline preko reduktivnega TCA cikla omejena aktivnost citosolne fumaraze. Fumaraze iz različnih organizmov pa imajo različne katalitične lastnosti, zato so poskusili uvesti zapis za fumarazo iz štirih različnih organizmov v sev iz prejšnjega koraka in s tem dobili 4 nove različne seve. Kot najbolj primerna za uporabo v M.thermophila se je izkazala fumaraza iz C.krusei.[1]

3.3 Prekinitev znotrajcelične razgradnje fumarata

V mikroorganizmih se fumarat ( v odvisnosti od nahajanja fumaraze, v mitohondriju ali citosolu) lahko pretvori v malat ali pa sukcinat. S pomočjo sistema CRISPR/Cas9 so prekinili ustrezne gene in s tem prekinili razgradnjo fumarata v mitohondrijih in citosolu, kar je vodilo do povečane proizvodnje fumarne kisline v citosolu.[1]

3.4 Izboljšanje sinteze fumarata, s povišanjem koncentracije prekurzorja

V uporabljenih sevih, kot prekurzor za proizvodnjo fumarne kisline preko reduktivnega TCA cikla služi malat. Ker se citosolni malat preko membrane prenese v mitohondrije, so raziskovalci sklepali, da bi prekinitev prenosa ter s tem povečanje njegove koncentracije v citosolu lahko povečalo proizvodnjo fumarne kisline. S tem namenom so prekinili gen, ki zapisuje za prenašalno molekulo MOC inpridobili sev s povečano koncnetracijo malata v citoslou ter s tem povečano sposobnostjo sinteze fumarne kisline.[1]

3.5 Povečanje učinkovitosti izvoza fumarata iz mitohondrijev

Z namenom povečanja učinkovitosti izvoza fumarata iz mitohondrijev so gen Mtsfc, ki zapisuje za transporter povezali z močnim konstitutivnim promotorjem eif ter ga prekomerno izražali. Pripravili so 30 transformant z različnim številom kopij gena, kot najboljša se je izkazal sev z 9 kopijami gena Mtsfc.[1]

4 Rezultati

Raziskovalci so bili pri svojem delu uspešni, končni sev je bil sposoben proizvodnje 17 g fumarne kisline na liter gojišča oz. z donosom 0,24 g fumarne kisline na gram glukoze. S tem so dosegli zastavljeni cilj in pokazali, da je ta gliva primerna za proizvodnjo organskih kislin ter, da imamo tehnologijo in znanje s pomočjo katerih lahko izboljšamo oz. usmerimo njen metabolizem v našo korist. Ker je ta gliva sposobna izločanja celulaznih encimov ter razgradnje celične stene rastlin, jo bomo morda v prihodnje lahko uporabili za proizvodnjo organskih kislin iz obnovljivih lignoceluloznih virov.[1]

5 Viri

[1] S. Gu et al., Metabolic engineering of the thermophilic filamentous fungus Myceliophthora thermophila to produce fumaric acid, Biotechnology for Biofuels, 11(1), 2019, str. 1-10 [2] https://www.dyadic.com/wp-content/uploads/2018/01/PEGS-Europe-November-2018.pdf dostopano : 4.5.2019 [3] https://thechemco.com/chemical/fumaric-acid/ dostopano 4.5.2019