Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih

Izhodiščni članek: H. Li, Q. Zhang, Y. Gu, Y. Wu, Y. Wang, L. Wang, S. Feng, Y. Hu, Y. Zheng, … D. Li: Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2021, 117(52), str. 33426–33435.

UVOD

Precizno gensko inženirstvo, ki bi v organizmu delovalo specifično na posamezne celice, je v časovnem in prostorskem spektru težko dosegljivo. V te namene se pri sintezni biologiji uporabljajo različne mestno specifične rekombinaze, na primer tirozinske rekombinaze. Sposobne so uvajati delecije, integracije, inverzije in tudi translokacije genomske DNA in to brez pomožnih proteinov. Kljub temu, da so v preteklosti dokazali veliko uporabnost rekombinaznih sistemov v genskem inženirstvu, imajo sistemi s samo eno rekombinazo mnoge ovire, ki preprečujejo razvoj zapletenih genetskih modelov.^1,2

V raziskavi, ki jo bom kratko opisala, so pripravili zelo učinkovito svetlobno inducibilno Dre rekombinazo (PA-Dre), dokazali, da uspešno regulira gene v specifičnih mišjih tkivih, razvili pa so tudi dvojni rekombinazni sistem CALID (ang. Cre-activated light-inducible Dre system).¹

UPORABA SPECIFIČNIH REKOMBINAZ V SINTEZNI BIOLOGIJI

Zaradi enostavne uporabe in velike specifičnosti se v sesalskih sistemih uporablja predvsem sistem Cre/loxP. Razvili so mnoge mutirane seve mišk, ki izražajo rekombinazo Cre pod določenimi tkivno specifičnimi promotorji. Taki sevi mišk so uporabni med drugim tudi kot modeli človeških bolezni.^1,2

Novejši sistem je sistem Dre/rox, ki so ga odkrili v bakteriofagu D6. Rekombinaza Dre je homologna Cre, mesto rox pa se od mesta loxP razlikuje samo v trinajst nukleotidih od dvaintridesetih. Kljub podobnostim v veliki večini primerov ne prihaja do prečne rekombinacije med sistemoma, zato lahko z njima sestavljamo dvojne rekombinazne sisteme. Prednost Dre pred Cre je prav tako, da nima nobenih toksičnih učinkov na celice.²

V zadnjih nekaj desetletjih razvijajo inducibilne variante rekombinaznih sistemov Cre, poleg kemijsko inducibilnih tudi nekaj svetlobno inducibilnih sistemov, kot sta na primer CRY2-CIB1-PA-Cre in Magnets-PA-Cre. Sistem Magnets, ki se je v tej raziskavi izkazal kot bolj učinkovit, je od modre svetlobe odvisen dimerizacijski sistem, sestavljen iz dveh svetlobnih stikal, imenovanih pozitivni magnet (pMag) in negativni magnet (nMag). Gre za flavin vezavni fotoreceptor, izoliran iz glive. Svetlobno inducibilni sistemi imajo veliko prednosti, omogočajo večjo časovno in prostorsko specifičnost, višjo možnost nadzora in hitro penetracijo tkiva, prav tako pa svetloba za tkivo ni invazivna.^1,3

REZULTATI

IDENTIFIKACIJA CEPITVENEGA MESTA Dre

Ker so vse dotedanje raziskave temeljile predvsem na cepljeni Cre rekombinazi, so na podlagi podatkov o njej sklepali na določena mesta cepitve, s katerimi bi Dre ločili na N- in C-končni del tako, da bi se jima ob ponovnem združenju povrnila rekombinazna aktivnost. Uporabili so računalniške metode in identificirali 6 takih mest. Najboljše rezultate so dobili pri treh načinih cepljenja, DreN₆₀/DreC₆₁, DreN₁₅₀/DreC₁₅₁ in DreN₂₄₆/DreC₂₄₇.¹

OPTIMIZACIJA PA-Dre

Pri testiranju in vitro se je kot fuzijski partner, odgovoren za dimerizacijo, najbolje izkazal sistem Magnets in sicer v primeru, da so na N konec Dre vezali nMag in na C konec Dre pMag. Ugotovili so, da zmanjšajo ozadje z uporabo linkerja L4, ki hkrati tudi ni poslabšal možnosti rekombinacije. Da bi dodatno zmanjšali ozadje s subcelično lokalizacijo polovic Dre, so dodali jedrni lokalizacijski signal iz nukleoplazmina (NLS^NLP) na C konec DreC₂₄₇. Dosegli so dodatno zmanjšanje ozadja in kar 102,2-kratno povečanje luciferazne aktivnosti.¹

Pri sestavljanju vektorja so želeli povezati tako optimizirana fuzijska partnerja Dre-N₂₄₆-nMag (PA-DreN) in pMag-DreC₂₄₇ -NLS^NLP (PA-DreC). Povezali so ju na tak način, da so med oba zapisa dodali zapis za enega izmed samocepilnih peptidov 2A. Ugotovili so, da uporaba T2A, ki ima sicer manjšo avtokatalitično sposobnost od P2A, izboljša razmerje signal/šum, se je pa izkazalo, da je tako razmerje singal/šum, kot tudi učinkovitost rekombinacije boljša, če uporabimo dva ločena vektorja. Prav tako je učinkovitost rekombinacije višja kot pri celem divjem tipu rekombinaze Dre. Najbrž fuzija s sistemom Magnets povzroči nastanek konformacijske oblike z višjo aktivnostjo. Z molekulsko dinamiko so potem dokazali, da je vezava na DNA približno enako stabilna kot pri divjem tipu Dre.¹

Prav tako so dokazali, da sistem razpolovljene Dre deluje tudi v fuziji z drugimi dimerizacijskimi sistemi. Preizkusili so dimerizacijski sistem, občutljiv na modro svetlobo Vivid (VVD) iz gliv, sistem za zaznavo rdeče svetlobe (PhyB-PIF3) in svetlobo valovne dolžine na meji z IR (Bphp1-Q-PAS1), pa tudi s kemičnim stikalom FKBP-FRB.¹

KARAKTERIZACIJA PA-Dre IN VITRO

Najprej so natančno določili čas osvetlitve z modro svetlobo in intenziteto odziva v celicah HEK-293T, transfeciranih s PA-Dre in reporterjem rox-stop-rox-Rluc (luciferaza iz korale). Različno dolgo so jih izpostavili svetlobi ali jih pustili rasti v temi. Ugotovili so, da pri osvetlitvi med 4 in 32 ur luciferazna aktivnost opazno raste, nato pa doseže plato. Sistem je bil odziven na modro svetlobo intenzitete 0,25 do 4 mW/cm², maksimum je dosegel pri 1 mW/cm². Podobne rezultate so dobili tudi, če so uporabili drugi reporter, CMV-rox-stop-rox-zsGreen (zelen fluorescenčni protein). Sistem je dobro deloval tudi v drugih celičnih linijah iz drugih sesalskih tkiv. Da je sistem kompatibilen tudi z drugimi močnimi promotorji so sklepali, ker so pri uporabi različnih promotorjev dobili dobro razmerje singal/šum in močen odziv na obsevanje z modro svetlobo. Prav tako je Dre deloval na različnih mutiranih rox zaporedjih.¹

Veliko prednost pred kemijsko inducibilnimi imajo svetlobno inducibilni sistemi v prostorskem smislu. To so dokazali tako, da so z uporabo maske osvetljevali petrijevke z rastočimi celicami, transfeciranimi s PA-Dre in reporterjem rox-stop-rox-zsGreen. Fluorescenčni odziv so zaznali samo v osvetljenih celicah, meja med fluorescirajočimi in temnimi celicami pa je bila razmeroma ostra.¹

SVETLOBNA AKTIVACIJA EKSPRESIJE GENOV S SISTEMOM PA-Dre IN VIVO

Kot reporterski sistem so pri in vivo eksperimentih uporabili rox-stop-rox-Fluc (luciferaza iz kresničke). Skupaj s plazmidi z zapisom za PA-Dre so jih injicirali preko repne vene miši in jih tako dostavili v jetra. Miške so nato po 8 urah osvetljevali z modro svetlobo, kontrolno skupino pa so pustili v temi. Luciferazno aktivnost so merili 24 ur po injekciji. Dobili so podobne rezultate kot in vitro; 30 min trajajoča osvetlitev je povzročila opazno luciferazno aktivnost, ki pa je tudi naraščala z daljšim časom obsevanja. Ugotovili so tudi, da lahko uspešno rekombinacijo dosežejo že s 30 sekundnim obsevanjem, če so v miške injicirali večje količine plazmidov.¹

Primerjava rekombinacije, dosežene s PA-Dre in do tedaj uporabljanje PA-Cre, je pokazala, da ima PA-Dre bistveno izboljšano razmerje signal/šum, kar kaže na to, da je novi sistem dosti bolj strikten. Dokazali pa so tudi, da lahko sistem uspešno dostavljajo v tarčna tkiva (jetra, možgane) preko z adenovirusi povezanih virusov (AAV).¹

SISTEM CALID

S svetlobo inducirani rekombinazi Cre in Dre sta potencialno zelo uporabni pri prostorsko in časovno kontroliranem genskem inženirstvu, a imata nekaj težav pri specifični aktivaciji glede na tip celice. Da bi naredili celično specifični sistem, so razvili dvojni rekombinazni sistem CALID. Pripravljeni konstrukti so vsebovali tkivno specifična promotorja, zapis za Cre in z mesti loxP obkrožen invertiran zapis za PA-Dre. Pri genskem inženirstvu bi tako lahko dodali samo še gen, ki nas zanima, zapisan navzdol od stop kodona, ustrezno obkroženega z dvema rox mestoma. V celicah, kjer je prisotna rekombinaza Cre, bi ta popravila orientacijo rekombinaze PA-Dre, ta pa bi šele po osvetljevanju s svetlobo izrezala stop kodon in povzročila izražanje gena. S tem bi dosežegli elegantnejšo trojno kontrolo rekombinacije.¹

AVV9 z zapisom za sistem CALID so skupaj z rekombinazo Cre injicirali v hipokampus odrasle miške R26-RSR-tdTomato. Po enem tednu so jih osvetljevali z optičnimi vlakni in opazili rdečo fluorescenco samo v nevronih, ki so vsebovali Cre in so bili obsevani. Primerjali so intenziteto fluorescence v odvisnosti od časa osvetlitve med 1s in 5 min. Ugotovili so pozitivno korelacijo med trajanjem osvetlitve in obsegom fluorescence, se pravi številom označenih nevronov. Obstajajo pa številni sevi mišk s tkivno specifičnim izražanjem rekombinaze Cre, v katerih bi bil sistem CALID uporaben. Raziskave so ponovili tudi v takih miškah, rezultati so bili primerljivi.¹

ZAKLJUČEK

V raziskavi so opisali pripravo in optimizacijo sistema svetlobno inducibilne rekombinaze Dre. Ob prisotnosti modre svetlobe fuziran sistem Magnets poskrbi za dimerizacijo rekombinaze Dre, ki šele pod temi pogoji dobi povrnjeno aktivnost. Dokazali so delovanje sistema in vitro in tudi in vivo v mišjih modelih. Za lažjo časovno in prostorsko kontrolo rekombinacije so sestavili tudi od Cre odvisen svetlobno inducibilni Dre sistem, imenovan CALID. Z njim so dosegli specifično označevanje nevronov v mišjih možganih v željenem obsegu. Predvidevajo, da bodo s takim sistemom omogočili bolj detajlne raziskave v širšem področju bioloških znanostih.¹

VIRI

1. H. Li, Q. Zhang, Y. Gu, Y. Wu, Y. Wang, L. Wang, S. Feng, Y. Hu, Y. Zheng, … D. Li: Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2021, 117(52), str. 33426–33435.

2. M. Karimova, O. Baker, A. Camgoz, R. Naumann, F. Buchholz, K. Anastassiadis: A single reporter mouse line for Vika, Flp, Dre, and Cre-recombination. Sci. Rep. 2018, 8(1), str. 1–12.

3. F. Kawano, R. Okazaki, M. Yazawa, M. Sato: A photoactivatable Cre-loxP recombination system for optogenetic genome engineering. Nat. Chem. Biol. 2016, 12(12), str. 1059–1064.