B.O.T.: Bakterijska oscilacijska terapija za zdravljenje kolorektalnega raka

Projekt B.O.T. je študentski projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, ki so ga osnovali študentje podiplomskega študija iz Lozane v Švici. Namen projekta je bil vnos oscilirajočega sistema v probiotske bakterije. Le-te bi nato v intervalih sintetizirale azurin, ki bi služil kot terapevtik za zdravljenje kolorektalnega raka.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:UNILausanne

Avtorica povzetka: Neža Pavko

Uvod

Kolorektalni rak

Kolorektalni rak je tretja najpogostejša oblika raka in po vrsti četrti vzrok za smrt povezano z rakom. Za zdravljenje kolorektalnega raka se najpogosteje uporablja kombinacija tehnik, in sicer kemoterapije, radioterapije in opreativne odstranitve. Kemoterapija in operativni poseg sta predvsem pri napredovali bolezni učinkovita le v omejenem obsegu [1].

Kronoterapija

Pri zdravljenju kolorektalnega raka se je za učinkovito izkazala kronoterapija, ki temelji na administraciji protirakavih učinkovin v določeni točki cirkadianega ritma. Cirkadiani ritem je lastnost procesov v živih organizmih, ki se ciklično spreminjajo v odvisnosti od dnevno-nočnega cikla pogojev v njihovem okolju, torej s periodo 24 ur. Na ta način se lahko izboljša učinkovitost zdravljenja, hkrati pa zmanjša neželene učinke terapije. S projektom so želeli raziskati možnost kombiniranja kronoterapije in terapije z bakterijami, kot nove metode za boj proti kolorektalnemu raku [2], [3].

Azurin

Kot protirakavo učinkovino so izbrali azurin, ki ga v osnovi proizvaja Pseudomonas aeruginosa. Azurin preferenčno vstopa v človeške rakaste celice, kjer inducira apoptozo ali zavira njihovo rast. Najbolj proučen način delovanja azurina je tvorba kompleksov s tumor supresorskim proteinom p53 in stabilizacija le-tega. Kompleksi p53/azurin potujejo v jedro, kjer p53 aktivira transkripcijo proapoptotskih genov, kot sta Bax in Noxa. p53 aktivira tudi ekspresijo inhibitorjev celičnega cikla [4].

Ideja

Skupina je idejo o kronoterapiji za zdravljenje kolorektalnega raka uporabila kot osnovo za svoj projekt, pri katerem so v probiotski sev Escherichia coli Nissle 1917 Δclb uvedli represilatorski sistem. S tem so želeli doseči oscilirajoče izražanje protirakave učinkovine azurin. Sev E. coli Nissle 1917 Δclb so izbrali na podlagi dokazov, da lahko penetrirajo v tumorje bolje kot ostali sevi zaradi svoje anaerobne karakteristike. Omenjeni sev so uporabili že v mnogih raziskavah in nekaterih kliničnih študijah (1. faza) za dostavo protirakavih učinkovin [5]. Represilatorski sistem so želeli prilagoditi za produkcijo azurina in celotni sistem preizkusiti na Caco-2 celicah, ki so jih izbrali kot in vitro model. V razvoj projekta so vključili tudi vidik biološke varnosti. Vnos genetsko spremenjenega organizma v telo oz. okolje bi lahko imelo svoje negativne posledice, zato so se odločili za uporabo samomorilskega stikala, ki bi služil kot varnostni mehanizem [6].

Zasnova projekta in laboratorijsko delo

Represilator

Pri oblikovanju represilatorskega sistema so izhajali iz plazmida, ki vsebuje tri gene – tetR iz Tn10 transpozona, cI iz bakteriofaga λ ter lacI iz laktoznega operona [7],[8]. Celotni represilatorski sistem pa je sestavljen iz dveh plazmidov – represilatorskega plazmida in sponge plazmida. Slednji služi za zmanjšanje šuma oscilacije. Sprva so preizkusili represilatorski sisem v bakterijskem sevu E. coli Nissle 1917 Δclb in merili fluorescenco različnih reporterskih genov v različnih časovnih točkah. Pokazali so, da se fluorescenčni proteini izražajo oscilirajoče, kot v osnovnem članku [8]. Temu je sledila modifikacija sponge plazmida, kamor so vstavili gen za reporterski protein oziroma gen za protirakavo učinkovino azurin, ki je pod regulacijo PLtetO1 promotorja. Azurin bi se tako izražal in izločal ob normalnem delovanju PLtetO1. Z vzpostavitvijo računskih modelov so lahko predvideli amplitudo in periodo oscilacije za izbran bakterijski in represilatorski sistem. Na podlagi modelov so lahko prevideli tudi, koliko časa bakterije sinhrono oscilirajo s predhodno sinhronizacijo z IPTG. Represilator bi glede na predhodne študije lahko deloval do 16 dni v črevesju miši [9], kar bi bil tudi časovni interval, na katerega bi pacient zaužil B.O.T. zdravilo. V simulacijah, ki jih je izvedla iGEM skupina, pa so pokazali, da bi bakterije sinhrono delovale krajši čas, zato bi bilo potrebno zdravilo zaužiti pogosteje.

Sekrecija in učinek azurina

Karakterizacije sinteze in sekrecije azurina so se lotili v treh korakih: i) izolacija azurina, sintetiziranega z ekspresijskim sevom E. coli, ii) dokazovanje, da je sintetiziran protein res azurin, iii) dokazovanje sekrecije azurina (zaradi dodatka pelB-5D sekrecijske oznake). Za dokaz ekspresije so pripravili konstrukt, pri katerem so v pET22 vektor pod inducibilni T7 promotor vstavili gen za azurin z dodano His oznako. Po prvem poskusu izolacije se je izkazalo, da le-ta ne bo tako enostavna. Uporabljen konstrukt so nekoliko optimizirali in namesto His oznake uvedli 3XFLAG oznako na N-konec azurina. S tem so na koncu lahko uspešno dokazali sintezo in sekrecijo azurina. Učinek azurina, sintetiziranega v E. coli Nissle 1917 Δclb celicah, so želeli preizkusiti na Caco-2 celični liniji, ki se jo pogosto uporablja za raziskave povezane s kolorektalnim rakom. Za primerjavo učinka azurina na Caco-2 celično linijo so oblikovali eksperimente, pri katerih so uporabili že obstoječa protirakava zdravila (Anisomycin, Cisplatin, Doxorubicin, Salirasib in TNFα). Na koncu so ugotovili, da azurin na Caco-2 celice nima vpliva, vzrok za to pa je po vsej verjetnosti lahko sprememba v p53 signalni poti, ki je glavna in najbolje okarakterizirana tarča protirakave učinkovine azurin [4]. Če bi imeli več časa, bi učinek azurina preverili še na celični liniji HPK116.

Samomorilsko stikalo

Da bi se izognili razširitvi bakterij na neželena mesta telesa (npr. krvni obtok) ali v okolje, so oblikovali samomorilsko stikalo. Le-to je osnovano na dveh toksin-antitoksin parih: ccdB-ccdA (BBa_K3482016) in miniColicin-E2/IM2 (BBa_K3482017). Cilj je, da bi na mestih, kjer so bakterije nezaželene, prevladoval le toksin, zato bakterije ne bi preživele. V črevesju, kjer so bakterije zaželene, pa bi antitoksin nevtraliziral učinek toksina. Samomorilsko stikalo bi se odzivalo na spremembo dveh pogojev: i) temperatura, ii) koncentracija fosfata. V črevesju, kjer je temperatura visoka in koncentracija fosfata nizka, so prisotni permisivni pogoji za samomorilsko stikalo. Izven telesa, kjer je temperatura nižja, ter v krvnem obtoku, kjer je koncentracija fosfata višja, kot v črevesju, pa pride do sprožitve samomorilskega stikala. Da bi dosegli odzivnost samomorilskega stikala na temperaturo, so uporabili toplotno-inducibilni RNA termosenzor, ki so ga združili z geni za antitoksine, ter toplotno-represivni RNA termosenzor, ki so ga združili z geni za toksine. Odzivnost na koncentracijo fosfata so dosegli z združitvijo genov za antitoksine s promotorjem PphoB, ki ga je možno regulirati s spremembo koncentracije fosfata. Sistem so želeli izboljšati na način, da bi gene za toksine inkorporirali v genom celic in na ta način uvedli kontrolo glede na prisotnost plazmida v celici. Če bi bakterija izgubila plazmid, bi zanjo to pomenilo smrt. Posledično bi lahko iz uporabljenih plazmidov odstranili gene za odpornost na antibiotike in tako pripomogli pri boju proti odpornosti bakterij na antibiotike.

Glavni rezultati in zaključek

Skupina je uspešno oblikovala in sestavila represilatorski sistem za E. coli Nissle 1917 Δclb z namenom oscilirajoče produkcije in sekrecije protirakave učinkovine azurin za zdravljenje kolorektalnega raka. Dokazali so, da pripravljen represilatorski sistem deluje v izbrani šasiji in da se azurin sintetizira in izloča iz celic. Pri proučevanju učinka azurina na Caco-2 celično linijo so ugotovili, da le-ta na celice nima predvidenega učinka, zaradi spremenjene p53 signalne poti v celicah, ki pa je glavna tarča za azurin. Za biološko varnost produkta so sestavili samomorilsko stikalo, zaradi katerega B.O.T. bakterije ne bi preživele izven črevesja pacienta. Razvit bakterijski sistem, ki izloča azurin, bi v perspektivi lahko uporabili tudi za zdravljenje drugih oblik raka, saj lahko sev E. coli Nissle 1917 Δclb sorazmerno dobro kolonizira različne tipe tumorskega tkiva [10]. Azurin kot protirakava učinkovina pa se je izkazal kot učinkovit proti melanomu in raku dojke [4].

Viri

1. I. Mármol, C. Sánchez-de-Diego, A. Pradilla Dieste, E. Cerrada, M. Rodriguez Yoldi: Colorectal Carcinoma: A General Overview and Future Perspectives in Colorectal Cancer. Int. J. Mol. Sci. 2017, 18(1), str. 197.

2. M. Eriguchi, F. Levi, T. Hisa, H. Yanagie, Y. Nonaka, Y. Takeda: Chronotherapy for cancer. Biomed. Pharmacother. 2003, 57(SUPPL. 1), str. 92–95.

3. F. Lévi: Chronotherapeutics: The relevance of timing in cancer therapy. Cancer Causes Control 2006, 17(4), str. 611–621.

4. M. Gao, J. Zhou, Z. Su, Y. Huang: Bacterial cupredoxin azurin hijacks cellular signaling networks: Protein–protein interactions and cancer therapy. Protein Sci. 2017, 26(12), str. 2334–2341.

5. X. Yu, C. Lin, J. Yu, Q. Qi, Q. Wang: Bioengineered Escherichia coli Nissle 1917 for tumour-targeting therapy. Microb. Biotechnol. 2020, 13(3), str. 629–636.

6. B.O.T. Project Motivation https://2020.igem.org/Team:UNILausanne/Motivation (pridobljeno 17. 4. 2021).

7. M. B. Elowitz, S. Leibler: A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators. Nature 2000, 403(6767), str. 335–338.

8. L. Potvin-Trottier, N. D. Lord, G. Vinnicombe, J. Paulsson: Synchronous long-term oscillations in a synthetic gene circuit. Nature 2016, 538(7626), str. 514–517.

9. D. T. Riglar, D. L. Richmond, L. Potvin-Trottier, A. A. Verdegaal, A. D. Naydich, S. Bakshi, E. Leoncini, L. G. Lyon, J. Paulsson, P. A. Silver: Bacterial variability in the mammalian gut captured by a single-cell synthetic oscillator. Nat. Commun. 2019, 10(1), str. 4665.

10. J. STRITZKER, S. WEIBEL, P. HILL, T. OELSCHLAEGER, W. GOEBEL, A. SZALAY: Tumor-specific colonization, tissue distribution, and gene induction by probiotic Escherichia coli Nissle 1917 in live mice. Int. J. Med. Microbiol. 2007, 297(3), str. 151–162.