Translacijski procesi pri sintezi koronavirusnih proteinov

Uvod

RNA virusi imajo relativno majhne genome, zaradi selekcijskega pritiska, da imajo čim manjši genom. To v kombinaciji s kanonično evkariontsko translacijo mRNA, ki v veliki večini primerov dopušča zapis le za 1 protein, je pripeljalo do razvoja izražanja poliproteinov in subgenomske RNA, poleg tega pa še do številnih ne-kanoničnih translacijskih mehanizmov virusne mRNA v evkariontih, kot so vstop ribosoma znotraj mRNA, prepustno iskanje začetnega kodona, iniciacija z nekanoničnim začetnim kodonom, ribosomski preskok, reiniciacija translacije, ribosomski premik bralnega okvirja in prepustnim stop kodonom. Virusi se zanašajo na celične mehanizme gostitelja za razmnoževanje. Po okužbi gostiteljske celice virus spremeni delovanje celice, zato da poteka izražanje virusnih proteinov čim bolj učinkovito. To vključuje tudi inhibicijo translacija celične mRNA.

Mehanizmi translacije

Vloga 5' kape pri translaciji

Nekateri RNA virusi inhibirajo sintezo celičnih proteinov, s tem da s svojimi encimi proteolitično cepijo faktorje za iniciacijo translacije, ki se vežejo na 5'-kapo. Virusna mRNA se pa lahko še naprej nekanonično prevaja(npr. z vstopom ribosoma znotraj mRNA). Koronavirusi, po drugi strani, se zanašajo na kompleks eIF4F(evkariontski iniciacijski faktor 4F), ki se veže na 5'-kapo mRNA, za ekspresijo svojih proteinov.

Ribosomski premik bralnega okvirja

Koronavirusni genom se po vstopu v celico lahko začne takoj prevajati. Tako se izrazita gena ORF1a in ORF1ab. Za sintezo poliproteina 1ab je potreben -1 ribosomski premik bralnega okvirja. Do premika bralnega okvirja pride v regiji, kjer se bralna okvirja ORF1a in ORF1b prekrivata in je nujen za uspešno replikacijo koronavirusov. Signal za premik bralnega okvirja je sestavljen iz spolzkega zaporedja “UUUAAAC”, ki mu sledi kompleksna RNA zanka, ki se razlikuje med koronavirusi in sprememba njene strukture lahko močno vpliva na uspešnost premika bralnega okvirja. Na to vpliva tudi RNA-RNA interakcija med stimulatorno strukturo in zanko 3.

Ribosomski preskok

Pri prenosljivem koronavirusu gastroenteritisa(TGEV) je bil opažen ribosomski preskok pri ORF 3a. Ribosomski preskoki potrebujejo 5' iniciacijo translacije. Na mRNA, pri kateri je ta mehanizem prisoten, je pogosto kratek začetni odprti bralni okvir, nato pa ribosom pride do sekundarne strukture RNA, ki povzroči odcep velike podenote ribosoma, mala podenota se pa samo premakne mimo te strukture oz. "preskoči" del zaporedja in nadaljuje z iskanjem novega začetnega kodona. TGEV ima ORF 3a, ki mu manjka začetni kratek ORF, z tem mehanizmom se preskoči vodilno zaporedje.

Prepustno iskanje začetnega kodona

Številni koronavirusi (še posebej betakoronavirusi) imajo znotraj gena N (za nukleokapsidni protein) še en dodaten odprt bralni okvir. V MHV kodira za protein I, ki nekoliko zviša učinkovitost razmnoževanja, v SARS-CoV pa gre za protein 9b, ki naj bi pomagal pri izogibanju prirojenemu imunskemu sistemu.

Ker se pri iskanju začetnega kodona po kanoničnem mehanizmu upošteva prvi najdeni kodon, se mora pri prevajanju proteina I prvi AUG kodon nekako zaobiti, vendar le v majhnem deležu iniciacij, saj je potreben tudi N protein. To se tudi dejansko zgodi, saj Kozakovo zaporedje okoli prvega začetnega kodona odstopa od najučinkovitejše kombinacije. Zaradi tega se v določenem deležu primerov ribosom ne ustavi, ampak nadaljuje do začetnega kodona za protein I, ki ima učinkovitejše Kozakovo zaporedje.

Tudi SARS-CoV-2 ima znotraj ORF za protein S močno izražen notranji odprti bralni okvir, ki kodira za domnevno transmembranski protein neznane funkcije in se predvidoma prevaja preko prepustnega iskanja začetnega kodona. Znotraj ORF 3a je prav tako notranji bralni okvir, a se prevaja le v majhnem obsegu.

Vstop ribosoma znotraj mRNA (IRE)

Drug način prevajanja odprtih bralnih okvirjev, ki so navzdol od prvega bralnega okvirja, je vstop ribosoma znotraj mRNA oz. od 5’ kape neodvisna iniciacija. Na mRNA se tvori zapletena struktura (IRES - internal ribosome entry sequence), ki veže ribosom. Virusu to omogoča, da imajo v 5’ regiji pakirne in replikacijske elemente. Omogočajo tudi nadaljevanje translacije, tudi medtem ko je gostiteljeva translacija inhibirana.

V koronavirusih ta mehanizem najdemo v IBV in MHV. V IBV mRNA 3 kodira za tri polipeptide, 3a, 3b in 3c. Modifikacija te mRNA s 5’ zaporedjem, ki zaradi svoje strukture preprečuje iniciacijo 3a in 3b, vseeno ne prepreči translacije 3c-ja, ki se nahaja proti 3’ koncu. Zaporedje pred začetnim kodonom 3c tudi tvori 5 lasničnih zank, podobnih tistim v IRES pikornavirusov, ki bi lahko vezale rRNA. V MHV mRNA 5 kodira dva polipeptida - 5a in 5b. Če se navzgor od 5a vstavi še en odprti bralni okvir, se 5a več ne prevaja (od 5’ kape odvisna translacija), 5b pa se še vedno, kar izključuje prepustno iskanje.

Reiniciacija

Po prevajanju zelo kratkega ORF imajo ribosomi lahko še vedno vezane iniciacijske faktorje. Določen delež jih bo tako nadaljeval po mRNA. Po določenem času (in posledično prepotovanih nukleotidih), ki je potreben, da znova veže manjkajoče iniciacijske faktorje, lahko začne prevajati nov bralni okvir. Tako lahko virusi zmanjšajo obseg translacije nekaterih proteinov.

V koronavirusih takšne 3-13 aminokislin dolge ORF-je najdemo v genomski RNA navzgor od ORF 1a. Takšen kratek ORF zmanjša stopnjo translacije 1a in je evolucijsko ohranjen.

Proteinske interakcije

Neprevedene regije v koronavirusnih mRNA vsebujejo cis regulatorne elemente, ki interagirajo s raznolikimi gostitljevimi in virusnimi proteini in vplivajo na učinkovitost translacije.

Primer takšne interakcije je MHV N (nukleokapsidni) protein in 5’ vodilno zaporedje istega virusa. mRNA, ki imajo v svoji 5’ neprevedeni regiji to vodilno zaporedje, so v prisotnosti proteina N prevajanje večkrat učinkoviteje.

Koronavirusni nadzor nad gostiteljevo translacijo

Replikacija koronavirusov povzroči inhibicijo sinteze gostiteljevih proteinov. Raziskave na mišjem koronavirusu, ki spada med betakoronaviruse kažejo, da pride do zaviranja proizvodnje gostiteljske translacije predvsem 3-6 ur po okužbi z virusom. Identificirana sta bila 2 načina inhibicije, prvi je razgradnja 28S rRNA, ki je del velike podenote ribosoma (vezavna tarča še ni znana), drugi pa je razgradnja gostiteljeve mRNA.

Proteini, ki zavirajo gostiteljevo transkripcijo

Za oviranje transkripcije je odgovornih več proteinov, med drugim nestrukturni protein 1 (nsp1), ki se pri okužbi z SARS-CoV veže na malo podenoto ribosoma. Pri SARS CoV raziskovalci špekulirajo, da so cepitve mRNA posledica rezanja gostiteljevih lastnih endonukleaz (ki jih rekrutira nsp1 vezan na ribosom) v 5’ neprevedeni regiji (5’UTR), medtem ko je virusna mRNA odporna na tako razgradnjo zaradi zgradbe 5’UTR, ki prepreči interakcije med endonukleazo in virusno mRNA. Ker so ribosomi, ki imajo na malo podenoto vezan nsp1, tudi transkripcijsko neaktivni, se virusna mRNA lahko razgrajuje samo na ribosomih, na katere ta protein ni vezan. Možno je, da se ribosomi z vezanim nsp1 v manjši meri nahajajo v področjih celice z veliko koncentracijo virusne RNA, da lahko transkripcija le te poteka nemoteno. Pri SARS-CoV imajo vlogo še vsaj trije drugi proteini, S protein, ki se veže na eno od podenot eIF3, N protein, ki interagira z eEF1α. in protein 7a. Nsp1 MERS-Cov se nahaja tako v jedru kot v citoplazmi (pri SARS-CoV samo v citoplazmi) in tako vpliva na razgradnjo samo gostiteljevih mRNA molekul, medtem ko na virusna zaporedja, ki se nahajajo v citoplazmi ostanejo neprizadeta. Pri virusu virusnega vnetja želodca in črevesja (TGEV), ki spada med alfakoronaviruse pa inhibicija poteka brez vezave na ribosom, tarča nsp1 pa še ni znana.

ER stres

Zvijanje in modifikacije transmembranskih proteinov pri evkariontih poteka v endoplazemskem retikulumu. Če količina nezvitih in/ali nepravilno zvitih proteinov preseže zmogljivosti retikuluma se v celici sprožijo mehanizmi za odpravo presežka proteinov, ki zavrejo translacijo, pride do povečanja velikosti ER in razgrajevanja nepravilno zvitih proteinov. Eden izmed dogodkov, ki lahko vodijo do porušenja homeostaze znotraj ER je okužba s patogenom, na primer z virusom. Pri koronavirusih naj bi bil za to kriv predvsem S protein, zaradi svoje velikosti in močne glikozilacije. Dodaten stres za ER pa bi lahko predstavljali vezikli z dvojno membrano, ki so vključeni v proces transkripcije in po nekaterih študijah izvirajo iz ER.

RNA granule

Eden izmed odzivov celice na stres (virusno okužbo) je tvorba dveh tipov RNA granul v citoplazmi. Stresne granule so strukture, kjer se ob razpadu polisomov po fosforilaciji eIF2α (kar vodi v zmanjšanje nivoja translacije, kot odziv na stres) začasno shranijo iniciacijski kompleksi. Drugi tip so telesca P, ki so makromolekulski agregati, povezani z skladiščenjem in razgradnjo mRNA, ki so v celici prisotna že ob odsotnosti stresa. Študije kažejo da pride ob okužbi s koronavirusi do povečanja števila obeh tipov agregatov, zmanjšane koncentracije iniciacijskih kompleksov pa naj bi zavirale razmnoževanje virusa. Pri različnih virusih, ali ne pride do fosforilacije eIF2α (inhibicija fosforilacije oz. spodbujanje defosforilacije), ali pa ta ne vpliva na zmanjšanje transkripcijske aktivnosti virusne mRNA. Oboje skupaj virusu omogoča nadaljevanje transkripcije in kasneje translacije oz. v celoti replikacije navkljub defenzivnim mehanizmom celice.

Literatura

Nakagawa, K., Lokugamage, K. G. & Makino, S. Viral and Cellular mRNA Translation in Coronavirus-Infected Cells. Advances in Virus Research vol. 96 165–192 (Elsevier, 2016).

Firth, A. E. & Brierley, I. Non-canonical translation in RNA viruses. Journal of General Virology 93, 1385–1409 (2012).

Finkel, Y., Mizrahi, O., Nachshon, A. et al. The coding capacity of SARS-CoV-2. Nature 589, 125–130 (2021). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2739-1

Huang, C. et al. SARS Coronavirus nsp1 Protein Induces Template-Dependent Endonucleolytic Cleavage of mRNAs: Viral mRNAs Are Resistant to nsp1-Induced RNA Cleavage. PLoS Pathog 7, e1002433 (2011).