Uporaba sesalskega RNA-vezavnega proteina Musashi-1 kot alosterično reguliranega translacijskega represorja v E. coli: Difference between revisions
Markokovacic (talk | contribs) No edit summary |
Markokovacic (talk | contribs) |
||
| (10 intermediate revisions by the same user not shown) | |||
| Line 1: | Line 1: | ||
Izhodiščni članek: [https://elifesciences.org/articles/91777] | Izhodiščni članek: [https://elifesciences.org/articles/91777 Repurposing the mammalian RNA-binding protein Musashi-1 as an allosteric translation repressor in bacteria] | ||
| Line 8: | Line 8: | ||
== Protein Musashi-1 lahko regulira iniciacijo translacije v ''E. coli'' == | == Protein Musashi-1 lahko regulira iniciacijo translacije v ''E. coli'' == | ||
V raziskavi so želeli preveriti, ali sesalski RNA-vezavni protein Musashi-1 (MSI-1) lahko deluje kot potranskripcijski regulator v ''E. coli''. MSI-1 se pri sesalcih izraža predvsem v matičnih celicah živčne in epitelne linije. Ima pomembno vlogo pri diferenciaciji celic, regulaciji celičnega cikla in tumorogenezi, regulira pa tudi signalno pot Notch. Vsebuje dva RRM (RRM1 in RRM2), ki z nanomolarno afiniteto prepoznata konsenzno zaporedje RUnAGU na tarčni mRNA [1]. MSI-1 je alosterično inhibiran z nekaterimi maščobnimi kislinami, predvsem z ω-9 mononenasičenimi maščobnimi kislinami, ki vsebujejo med 18 in 22 ogljikovih atomov (npr. z oleinsko kislino) [2]. Uporabili so gen za mišji MSI-1, zato so optimizirali rabo kodonov za izražanje gena v ''E. coli''. Ker je C-končna regija mišjega MSI-1 nizko strukturno kompleksna, so z namenom povišanja topnosti proteina klonirali skrajšano obliko gena za MSI-1, ki je vključeval zapis za prvih 192 aminokislinskih ostankov. Izražanje gena za skrajšano obliko proteina (MSI-1*) je bilo pod nadzorom inducibilnega sintetičnega promotorja (poimenovan PLlac), ki je bil načrtovan na podlagi promotorja PL in reprimiran z represorjem LacI. Na transkripcijskem nivoju so z dodatkom laktoze ali β-D-1-tiogalaktopiranozida (IPTG) lahko inducirali izražanje gena za MSI-1*. Kot regulatorni element so uporabili Super folder GFP (sfGFP). Izražanje gena za sfGFP je bilo pod nadzorom konstitutivnega promotorja J23119. Zapis za sfGFP je po start kodonu vključeval dva prepoznavna motiva za MSI-1*, in sicer GUUAGU ter AUUUAGU, ki predvidoma tvorita sekundarno strukturo v obliki stebla. MSI-1* tako z vezavo na prepoznavna motiva na molekuli mRNA za sfGFP lahko zavre translacijo, saj sterično ovira vezavo ribosomalne podenote 30S na mRNA [1]. Tak način delovanja se razlikuje od tistega, ki poteka naravno pri sesalcih, saj se pri sesalcih MSI-1 veže na 3' UTR tarčne mRNA (''Numb'') in tako prepreči delovanje poli(A)-vezavnega proteina PABP | V raziskavi so želeli preveriti, ali sesalski RNA-vezavni protein Musashi-1 (MSI-1) lahko deluje kot potranskripcijski regulator v ''E. coli''. MSI-1 se pri sesalcih izraža predvsem v matičnih celicah živčne in epitelne linije. Ima pomembno vlogo pri diferenciaciji celic, regulaciji celičnega cikla in tumorogenezi, regulira pa tudi signalno pot Notch. Vsebuje dva RRM (RRM1 in RRM2), ki z nanomolarno afiniteto prepoznata konsenzno zaporedje RUnAGU na tarčni mRNA [1]. MSI-1 je alosterično inhibiran z nekaterimi maščobnimi kislinami, predvsem z ω-9 mononenasičenimi maščobnimi kislinami, ki vsebujejo med 18 in 22 ogljikovih atomov (npr. z oleinsko kislino) [2]. Uporabili so gen za mišji MSI-1, zato so optimizirali rabo kodonov za izražanje gena v ''E. coli''. Ker je C-končna regija mišjega MSI-1 nizko strukturno kompleksna, so z namenom povišanja topnosti proteina klonirali skrajšano obliko gena za MSI-1, ki je vključeval zapis za prvih 192 aminokislinskih ostankov. Izražanje gena za skrajšano obliko proteina (MSI-1*) je bilo pod nadzorom inducibilnega sintetičnega promotorja (poimenovan PLlac), ki je bil načrtovan na podlagi promotorja PL in reprimiran z represorjem LacI. Na transkripcijskem nivoju so z dodatkom laktoze ali β-D-1-tiogalaktopiranozida (IPTG) lahko inducirali izražanje gena za MSI-1*. Kot regulatorni element so uporabili Super folder GFP (sfGFP). Izražanje gena za sfGFP je bilo pod nadzorom konstitutivnega promotorja J23119. Zapis za sfGFP je po start kodonu vključeval dva prepoznavna motiva za MSI-1*, in sicer GUUAGU ter AUUUAGU, ki predvidoma tvorita sekundarno strukturo v obliki stebla. MSI-1* tako z vezavo na prepoznavna motiva na molekuli mRNA za sfGFP lahko zavre translacijo, saj sterično ovira vezavo ribosomalne podenote 30S na mRNA [1]. Tak način delovanja se razlikuje od tistega, ki poteka naravno pri sesalcih, saj se pri sesalcih MSI-1 veže na 3' UTR tarčne mRNA (''Numb'') in tako prepreči delovanje poli(A)-vezavnega proteina PABP ter zavre translacijo [3]. Pri tako sestavljenem sinteznobiološkem vezju sta torej vhodna signala bila laktoza (ali IPTG) in oleinska kislina, izhodni signal je bila fluorescenca sfGFP. Takšno obnašanje sistema opišejo logična vrata IMPLY, torej se sfGFP ne izraža le v primeru, da je v sistemu laktoza (ali IPTG) in v sistemu ni oleinske kisline. Delovanje sinteznobiološkega vezja so okarakterizirali s fluorimetrijo, merili so fluorescenco sfGFP (v AU) v odvisnosti od koncentracije laktoze (do 1 mM). Pri 1 mM koncentraciji laktoze je MSI-1* znižal sintezo sfGFP, in sicer za faktor 2.5. IPTG je povzročil zelo podoben odziv. Meritve celične rasti za vse indukcijske pogoje so pokazale, da ekspresija gena za mišji protein MSI-1* ni povzročila motenj v rasti bakterijskih celic [1]. | ||
== Mehanizem interakcije med MSI-1* in prepoznavnim motivom na mRNA == | == Mehanizem interakcije med MSI-1* in prepoznavnim motivom na mRNA == | ||
Natančnejši vpogled v mehanizem interakcije med MSI-1* in prepoznavnima motivoma na mRNA, ki zapisuje za sfGFP, je omogočil izračun disociacijske konstante | Natančnejši vpogled v mehanizem interakcije med MSI-1* in prepoznavnima motivoma na mRNA, ki zapisuje za sfGFP, je omogočil izračun disociacijske konstante Kd med mRNA in MSI-1*. Točkovna mutacija v enem prepoznavnem motivu (RUnCGU, mutanta 1) je povzročila zgolj 1.4x znižanje sinteze sfGFP v prisotnosti MSI-1* [1], s čimer so potrdili ugotovitev predhodnih raziskav, da je zaporedje UAG na prepoznavnem motivu ključno za specifično prepoznavo prepoznavnega motiva z MSI-1 [4]. Točkovni mutaciji v obeh prepoznavnih motivih (UAC namesto UAG, mutanta 5) sta povzročili zelo podoben odziv. Reporterski sistem z najkrajšim možnim konsenznim zaporedjem AUAGU ni pokazal nobene regulacije z MSI-1*, kar pomeni, da sta dve kopiji konsenznega zaporedja ključni za uspešno regulacijo izražanja gena za tarčni protein z MSI-1*. Pri ''in vitro'' eksperimentih vezavne kinetike so uporabili skrajšano obliko gena za človeški MSI-1h*. Meritve so izvajali s tehnologijo switchSENSE, ki omogoča meritve molekulske dinamike na čipu. dsDNA, imobilizirana na elektrodo iz Au v čipu, je imela fluorofor na enem koncu in prepoznavni motiv za vezavo MSI-1h* na drugem koncu. Vezava MSI-1h* (injiciran analit) na RNA povzroči spremembe v fluorescenci, ki se merijo v realnem času in omogočajo izračun kinetičnih konstant. V primeru originalnega prepoznavnega motiva na RNA (brez točkovnih mutacij) so dobili stopnjo asociacije kon = 1.1 nM-1 min-1, povprečen čas zadrževanja proteina MSI-1* na tarčni mRNA je bil 1.5 min (1/koff, koff je stopnja disociacije). Pri mutanti 1 je bila stopnja asociacije podobna kot pri nemutiranem prepoznavnem motivu, stopnja disociacije pa skoraj 4x hitrejša. Pri mutanti 5 pa sta bili moteni tako stopnja asociacije (15x manjša hitrost) kot stopnja disociacije (10x večja hitrost). Disociacijska konstanta Kd (= koff/kon) je 0.62 nM za nemutirano obliko prepoznavnega motiva in 87 nM za mutanto 5 [1]. | ||
== Spreminjanje prepoznavnega motiva na mRNA z namenom povišanja dinamičnega razpona odziva == | == Spreminjanje prepoznavnega motiva na mRNA z namenom povišanja dinamičnega razpona odziva == | ||
Raziskovalci so želeli preveriti, ali bi s spreminjanjem prepoznavnega motiva na mRNA za vezavo MSI-1 in z dodajanjem novih prepoznavnih motivov lahko povečali dinamičen razpon odziva. Najboljše rezultate je dal | Raziskovalci so želeli preveriti, ali bi s spreminjanjem prepoznavnega motiva na mRNA za vezavo MSI-1 in z dodajanjem novih prepoznavnih motivov lahko povečali dinamičen razpon odziva. Najboljše rezultate je dal reporterski sistem (redesign 3), ki je poleg obeh prepoznavnih motivov po start kodonu (sekundarna struktura v obliki zanke) vključeval še spremembe na 5' UTR zapisa za sfGFP. Na 5' UTR sta bila dodana dodatna prepoznavna motiva RUnAGU (GUUUAGU in AUUUAGU), ki sta obkrožala RBS in predvidoma nista tvorila sekundarnih struktur. Mišji MSI-1* je tako blokiral tudi vezavo RNA dela ribosomske podenote 30S. Ta reporterski sistem je povzročil približno 2x povišanje maksimalnega izražanja gena (brez laktoze) za sfGFP in 8.6x znižanje maksimalnega izražanja gena za sfGFP z MSI-1*, kar je v primerjavi z originalnim reporterskim sistemom (2 nemutirani prepoznavni zaporedji), kjer je bilo maksimalno znižanje izražanja gena 2.5x, velik napredek. Primerjava Hillovih koeficientov pri originalnem sistemu in redesign 3 (4.5 pri redesign 3, 1.7 pri originalnem sistemu) nakazuje na pozitivno kooperativnost vezave obeh molekul proteina MSI-1*, ki se lahko vežeta vsak na po 2 prepoznavni mesti [1]. | ||
== MSI-1* je alosterično inhibiran z oleinsko kislino == | == MSI-1* je alosterično inhibiran z oleinsko kislino == | ||
Protein MSI-1 je alosterično inhibiran z oleinsko kislino, ki se veže na domeno RRM1 na MSI-1 in preko konformacijske spremembe MSI-1 prepreči | Protein MSI-1 je alosterično inhibiran z oleinsko kislino, ki se veže na domeno RRM1 na MSI-1 in preko konformacijske spremembe MSI-1 prepreči prepoznavo tarčne RNA. Z eksperimentom, ki temelji na spremenjeni mobilnosti molekul pri elektroforezi, so potrdili interakcijo med MSI-1* (koncentracija 45 µM) in RNA (koncentracija 11 µM), ki je bila popolnoma motena v prisotnosti 1 mM oleinske kisline. ''E. coli'' ima transporterja FadL in FadD za vnos maščobnih kislin iz okolja. Z meritvami fluorescence sfGFP v posameznih celicah so ugotovili, da se je pri originalnem reporterskem sistemu (nemutirani prepoznavni mesti) delež celic v stanju ON (fluorescenca sfGFP nad določeno mejo) dvignil iz 10 % (pri 1 mM laktozi) na 49 % po dodatku 20 mM oleinske kisline. Prvotnih 93 % celic v stanju ON (ko ni bilo laktoze v sistemu) se ni povrnilo, najverjetneje ker se je oleinska kislina delno razgradila po vstopu v celice [1]. | ||
== Aplikacije proteina Musashi-1 == | == Aplikacije proteina Musashi-1 == | ||
Transkripcijska regulacija ima svoje omejitve pri regulaciji specifičnega gena znotraj operona. Protein Musashi-1 bi lahko reguliral izražanje specifičnega gena, ki je del policistronskega operona. To bi lahko bilo uporabno pri regulaciji izražanja | Transkripcijska regulacija ima svoje omejitve pri regulaciji specifičnega gena znotraj operona. Protein Musashi-1 bi lahko reguliral izražanje specifičnega gena, ki je del policistronskega operona. To bi lahko bilo uporabno pri regulaciji izražanja genov za številne encime pri metabolnih poteh, torej pri metabolnem inženiringu. Uporaben bi bil tudi v kombinaciji s transkripcijskimi regulatorji, s čimer bi dosegli bolj raznoliko kombinirano regulacijo. Raziskovalci so z namenom potrditve teh dveh aplikacij proteina Musashi sestavili novo vezje, kjer sta ''sfGFP'' in ''mScarlet'' tvorila eno transkripcijsko enoto (bicistronski operon) pod nadzorom inducibilnega sintetičnega promotorja (PLtet), načrtovanega na podlagi promotorja PL, ki je bil reguliran s tetraciklinskim represorjem (TetR). Z dodatkom anhidrotetraciklina (aTC) so omogočili prepisovanje genov za sfGFP in mScarlet. Prepoznavni motivi na mRNA za vezavo MSI-1* so bili zgolj na začetku zapisa za sfGFP. Gen za MSI-1* je bil pod nadzorom promotorja PLlac, torej je za začetek transkripcije zapisa za MSI-1* bil potreben dodatek laktoze (ali IPTG). Obnašanje sistema opišejo logična vrata NIMPLY, pri čemer se zapis za sfGFP izraža zgolj v primeru prisotnosti aTC v sistemu in v odsotnosti laktoze v sistemu. Z dodatkom laktoze (1 mM) in aTC (100 ng/mL) v vseh kombinacijah (brez obeh, zgolj eden, oba) so pokazali specifično regulacijo izražanja gena za sfGFP v bicistronskem operonu in sposobnost kombiniranja regulatornih signalov z namenom združitve transkripcijske in potranskripcijske regulacije. Protein Musashi-1 je pokazal velik potencial pri potranskripcijski regulaciji v ''E. coli'', kar odpira možnosti za raziskave delovanja tudi drugih heterolognih RNA-vezavnih proteinov z RRM pri preprostejših organizmih [1]. | ||
== Literatura == | == Literatura == | ||
Latest revision as of 17:02, 14 April 2024
Izhodiščni članek: Repurposing the mammalian RNA-binding protein Musashi-1 as an allosteric translation repressor in bacteria
Uvod
Regulacija izražanja genov na potranskripcijskem nivoju se pri prokariontih in evkariontih razlikuje. Evkarionti imajo več RNA-vezavnih proteinov, ki imajo lahko številne funkcije in lahko delujejo tudi na specifičen način. Pri prokariontih stabilnost mRNA in iniciacijo translacije regulirajo predvsem majhne nekodirajoče RNA, RNA-vezavni proteini pa večinoma niso tako specifični. Pri živalih večina RNA-vezavnih proteinov vsebuje RNA-prepoznavne motive (RRM). RRM so majhne globularne domene, ki vključujejo okrog 90 aminokislinskih ostankov. Zvijejo se v 4 antiparalelne β-trakove in 2 α-vijačnici. Na enoverižno molekulo RNA se lahko vežejo z zadostno afiniteto in specifičnostjo ter tako specifično regulirajo biološke procese. Čeprav so RRM pomembni za potranskripcijsko regulacijo pri živalih, pa niso razširjeni pri vseh organizmih. Pri prokariontih je zelo malo proteinov z RRM, ki so bili odkriti predvsem z bioinformatskimi metodami, vendar pa imajo pogosto neznano funkcijo. Namen raziskave je bil odgovoriti na vprašanje, ali se živalski RRM lahko uporabijo v organizmih z enostavnejšo regulacijo izražanja genov. V kolikor bi to delovalo, bi potranskripcijska regulacija izražanja genov pri prokariontih preko specifičnih interakcij med heterolognimi RNA vezavnimi proteini z RRM in prokariontskimi mRNA ponudila številne nove možnosti za regulacijo sinteznobioloških vezij [1].
Protein Musashi-1 lahko regulira iniciacijo translacije v E. coli
V raziskavi so želeli preveriti, ali sesalski RNA-vezavni protein Musashi-1 (MSI-1) lahko deluje kot potranskripcijski regulator v E. coli. MSI-1 se pri sesalcih izraža predvsem v matičnih celicah živčne in epitelne linije. Ima pomembno vlogo pri diferenciaciji celic, regulaciji celičnega cikla in tumorogenezi, regulira pa tudi signalno pot Notch. Vsebuje dva RRM (RRM1 in RRM2), ki z nanomolarno afiniteto prepoznata konsenzno zaporedje RUnAGU na tarčni mRNA [1]. MSI-1 je alosterično inhibiran z nekaterimi maščobnimi kislinami, predvsem z ω-9 mononenasičenimi maščobnimi kislinami, ki vsebujejo med 18 in 22 ogljikovih atomov (npr. z oleinsko kislino) [2]. Uporabili so gen za mišji MSI-1, zato so optimizirali rabo kodonov za izražanje gena v E. coli. Ker je C-končna regija mišjega MSI-1 nizko strukturno kompleksna, so z namenom povišanja topnosti proteina klonirali skrajšano obliko gena za MSI-1, ki je vključeval zapis za prvih 192 aminokislinskih ostankov. Izražanje gena za skrajšano obliko proteina (MSI-1*) je bilo pod nadzorom inducibilnega sintetičnega promotorja (poimenovan PLlac), ki je bil načrtovan na podlagi promotorja PL in reprimiran z represorjem LacI. Na transkripcijskem nivoju so z dodatkom laktoze ali β-D-1-tiogalaktopiranozida (IPTG) lahko inducirali izražanje gena za MSI-1*. Kot regulatorni element so uporabili Super folder GFP (sfGFP). Izražanje gena za sfGFP je bilo pod nadzorom konstitutivnega promotorja J23119. Zapis za sfGFP je po start kodonu vključeval dva prepoznavna motiva za MSI-1*, in sicer GUUAGU ter AUUUAGU, ki predvidoma tvorita sekundarno strukturo v obliki stebla. MSI-1* tako z vezavo na prepoznavna motiva na molekuli mRNA za sfGFP lahko zavre translacijo, saj sterično ovira vezavo ribosomalne podenote 30S na mRNA [1]. Tak način delovanja se razlikuje od tistega, ki poteka naravno pri sesalcih, saj se pri sesalcih MSI-1 veže na 3' UTR tarčne mRNA (Numb) in tako prepreči delovanje poli(A)-vezavnega proteina PABP ter zavre translacijo [3]. Pri tako sestavljenem sinteznobiološkem vezju sta torej vhodna signala bila laktoza (ali IPTG) in oleinska kislina, izhodni signal je bila fluorescenca sfGFP. Takšno obnašanje sistema opišejo logična vrata IMPLY, torej se sfGFP ne izraža le v primeru, da je v sistemu laktoza (ali IPTG) in v sistemu ni oleinske kisline. Delovanje sinteznobiološkega vezja so okarakterizirali s fluorimetrijo, merili so fluorescenco sfGFP (v AU) v odvisnosti od koncentracije laktoze (do 1 mM). Pri 1 mM koncentraciji laktoze je MSI-1* znižal sintezo sfGFP, in sicer za faktor 2.5. IPTG je povzročil zelo podoben odziv. Meritve celične rasti za vse indukcijske pogoje so pokazale, da ekspresija gena za mišji protein MSI-1* ni povzročila motenj v rasti bakterijskih celic [1].
Natančnejši vpogled v mehanizem interakcije med MSI-1* in prepoznavnima motivoma na mRNA, ki zapisuje za sfGFP, je omogočil izračun disociacijske konstante Kd med mRNA in MSI-1*. Točkovna mutacija v enem prepoznavnem motivu (RUnCGU, mutanta 1) je povzročila zgolj 1.4x znižanje sinteze sfGFP v prisotnosti MSI-1* [1], s čimer so potrdili ugotovitev predhodnih raziskav, da je zaporedje UAG na prepoznavnem motivu ključno za specifično prepoznavo prepoznavnega motiva z MSI-1 [4]. Točkovni mutaciji v obeh prepoznavnih motivih (UAC namesto UAG, mutanta 5) sta povzročili zelo podoben odziv. Reporterski sistem z najkrajšim možnim konsenznim zaporedjem AUAGU ni pokazal nobene regulacije z MSI-1*, kar pomeni, da sta dve kopiji konsenznega zaporedja ključni za uspešno regulacijo izražanja gena za tarčni protein z MSI-1*. Pri in vitro eksperimentih vezavne kinetike so uporabili skrajšano obliko gena za človeški MSI-1h*. Meritve so izvajali s tehnologijo switchSENSE, ki omogoča meritve molekulske dinamike na čipu. dsDNA, imobilizirana na elektrodo iz Au v čipu, je imela fluorofor na enem koncu in prepoznavni motiv za vezavo MSI-1h* na drugem koncu. Vezava MSI-1h* (injiciran analit) na RNA povzroči spremembe v fluorescenci, ki se merijo v realnem času in omogočajo izračun kinetičnih konstant. V primeru originalnega prepoznavnega motiva na RNA (brez točkovnih mutacij) so dobili stopnjo asociacije kon = 1.1 nM-1 min-1, povprečen čas zadrževanja proteina MSI-1* na tarčni mRNA je bil 1.5 min (1/koff, koff je stopnja disociacije). Pri mutanti 1 je bila stopnja asociacije podobna kot pri nemutiranem prepoznavnem motivu, stopnja disociacije pa skoraj 4x hitrejša. Pri mutanti 5 pa sta bili moteni tako stopnja asociacije (15x manjša hitrost) kot stopnja disociacije (10x večja hitrost). Disociacijska konstanta Kd (= koff/kon) je 0.62 nM za nemutirano obliko prepoznavnega motiva in 87 nM za mutanto 5 [1].
Raziskovalci so želeli preveriti, ali bi s spreminjanjem prepoznavnega motiva na mRNA za vezavo MSI-1 in z dodajanjem novih prepoznavnih motivov lahko povečali dinamičen razpon odziva. Najboljše rezultate je dal reporterski sistem (redesign 3), ki je poleg obeh prepoznavnih motivov po start kodonu (sekundarna struktura v obliki zanke) vključeval še spremembe na 5' UTR zapisa za sfGFP. Na 5' UTR sta bila dodana dodatna prepoznavna motiva RUnAGU (GUUUAGU in AUUUAGU), ki sta obkrožala RBS in predvidoma nista tvorila sekundarnih struktur. Mišji MSI-1* je tako blokiral tudi vezavo RNA dela ribosomske podenote 30S. Ta reporterski sistem je povzročil približno 2x povišanje maksimalnega izražanja gena (brez laktoze) za sfGFP in 8.6x znižanje maksimalnega izražanja gena za sfGFP z MSI-1*, kar je v primerjavi z originalnim reporterskim sistemom (2 nemutirani prepoznavni zaporedji), kjer je bilo maksimalno znižanje izražanja gena 2.5x, velik napredek. Primerjava Hillovih koeficientov pri originalnem sistemu in redesign 3 (4.5 pri redesign 3, 1.7 pri originalnem sistemu) nakazuje na pozitivno kooperativnost vezave obeh molekul proteina MSI-1*, ki se lahko vežeta vsak na po 2 prepoznavni mesti [1].
MSI-1* je alosterično inhibiran z oleinsko kislino
Protein MSI-1 je alosterično inhibiran z oleinsko kislino, ki se veže na domeno RRM1 na MSI-1 in preko konformacijske spremembe MSI-1 prepreči prepoznavo tarčne RNA. Z eksperimentom, ki temelji na spremenjeni mobilnosti molekul pri elektroforezi, so potrdili interakcijo med MSI-1* (koncentracija 45 µM) in RNA (koncentracija 11 µM), ki je bila popolnoma motena v prisotnosti 1 mM oleinske kisline. E. coli ima transporterja FadL in FadD za vnos maščobnih kislin iz okolja. Z meritvami fluorescence sfGFP v posameznih celicah so ugotovili, da se je pri originalnem reporterskem sistemu (nemutirani prepoznavni mesti) delež celic v stanju ON (fluorescenca sfGFP nad določeno mejo) dvignil iz 10 % (pri 1 mM laktozi) na 49 % po dodatku 20 mM oleinske kisline. Prvotnih 93 % celic v stanju ON (ko ni bilo laktoze v sistemu) se ni povrnilo, najverjetneje ker se je oleinska kislina delno razgradila po vstopu v celice [1].
Aplikacije proteina Musashi-1
Transkripcijska regulacija ima svoje omejitve pri regulaciji specifičnega gena znotraj operona. Protein Musashi-1 bi lahko reguliral izražanje specifičnega gena, ki je del policistronskega operona. To bi lahko bilo uporabno pri regulaciji izražanja genov za številne encime pri metabolnih poteh, torej pri metabolnem inženiringu. Uporaben bi bil tudi v kombinaciji s transkripcijskimi regulatorji, s čimer bi dosegli bolj raznoliko kombinirano regulacijo. Raziskovalci so z namenom potrditve teh dveh aplikacij proteina Musashi sestavili novo vezje, kjer sta sfGFP in mScarlet tvorila eno transkripcijsko enoto (bicistronski operon) pod nadzorom inducibilnega sintetičnega promotorja (PLtet), načrtovanega na podlagi promotorja PL, ki je bil reguliran s tetraciklinskim represorjem (TetR). Z dodatkom anhidrotetraciklina (aTC) so omogočili prepisovanje genov za sfGFP in mScarlet. Prepoznavni motivi na mRNA za vezavo MSI-1* so bili zgolj na začetku zapisa za sfGFP. Gen za MSI-1* je bil pod nadzorom promotorja PLlac, torej je za začetek transkripcije zapisa za MSI-1* bil potreben dodatek laktoze (ali IPTG). Obnašanje sistema opišejo logična vrata NIMPLY, pri čemer se zapis za sfGFP izraža zgolj v primeru prisotnosti aTC v sistemu in v odsotnosti laktoze v sistemu. Z dodatkom laktoze (1 mM) in aTC (100 ng/mL) v vseh kombinacijah (brez obeh, zgolj eden, oba) so pokazali specifično regulacijo izražanja gena za sfGFP v bicistronskem operonu in sposobnost kombiniranja regulatornih signalov z namenom združitve transkripcijske in potranskripcijske regulacije. Protein Musashi-1 je pokazal velik potencial pri potranskripcijski regulaciji v E. coli, kar odpira možnosti za raziskave delovanja tudi drugih heterolognih RNA-vezavnih proteinov z RRM pri preprostejših organizmih [1].
Literatura
[1] R. Dolcemascolo, M. Heras-Hernández, L. Goiriz, R. Montagud-Martínez, A. Requena-Menéndez, R. Ruiz, A. Pérez-Ràfols, R. A. Higuera-Rodríguez, G. Pérez-Ropero, W. F. Vranken, et al.: Repurposing the mammalian RNA-binding protein Musashi-1 as an allosteric translation repressor in bacteria. Elife 2024, 12.
[2] C. C. Clingman, L. M. Deveau, S. A. Hay, R. M. Genga, S. M. D. Shandilya, F. Massi, S. P. Ryder: Allosteric inhibition of a stem cell RNA-binding protein by an intermediary metabolite. Elife 2014, 2014.
[3] H. Kawahara, T. Imai, H. Imataka, M. Tsujimoto, K. Matsumoto, H. Okano: Neural RNA-binding protein Musashi1 inhibits translation initiation by competing with eIF4G for PABP. Journal of Cell Biology 2008, 181, 639–653.
[4] N. Ruth Zearfoss, L. M. Deveau, C. C. Clingman, E. Schmidt, E. S. Johnson, F. Massi, S. P. Ryder: A conserved three-nucleotide core motif defines musashi RNA binding specificity. Journal of Biological Chemistry 2014, 289, 35530–35541.
