Inženirane mRNA-ribosomske fuzije za lažjo biosintezo selenoproteinov: Difference between revisions

From Wiki FKKT
Jump to navigationJump to search
No edit summary
 
(9 intermediate revisions by the same user not shown)
Line 3: Line 3:
==Uvod==
==Uvod==


V genetskem kodu, kot ga poznamo, vse možne kombinacije tripletov nukleotidov kodirajo za 20 aminokislin, zato te aminokisline imenujemo standardne ali proteinogene [1]. Kljub temu v naravi obstajajo tudi selenoproteini, to so proteini, ki v svojem zaporedju vsebujejo aminokislino, imenovano selenocistein (Sec), ki ne sodi med 20 standardnih aminokislin. Zato se pojavi vprašanje, kako se med translacijo v polipeptidno verigo vključi selenocistein, če zanj ni kodona? V naravi je Sec kodiran s kodonom UGA, ki je stop kodon. Da se zagotovi prevod kodona UGA v Sec, namesto v stop kodon, ima ta stop kodon na 3’ koncu dodano od 20 do 60 nukleotidov dolgo specializirano zaporedje, imenovano SECIS (vstavitveno zaporedje za selenocistein) [2]. SECIS element omogoča mRNA selenoproteinov, da rekrutirajo elongacijski faktor SelB, ki se nato veže na specializirani tRN<sup> Sec <sup>, ki prinaša Sec na aktivno mesto ribosoma. Ker selenoproteini kažejo višje katalitične hitrosti in odpornost proti nepovratni oksidaciji, kar omogoča Sec-vsebujočim proteinom hitrejše in daljše delovanje v primerjavi s Cys-vsebujočimi analogi, je sinteza načrtovanih selenoproteinov privlačna smer sintezne biologije [3]. Poznanih je že več strategij za sintezo selenoproteinov, vendar imajo nekatere pomanjkljivosti, saj zahtevajo dragocene in časovno zahtevne, včasih tudi nemogoče spremembe genetskega koda po celotnem genomu. Zato v članku A. Thaenert in sod. poročajo o novem pristopu k inženiringu ribosoma za sintezo načrtovanih selenoproteinov, ki temelji na fuziji med mRNA in ribosomom [4].
V genetskem kodu, kot ga poznamo, vse možne kombinacije tripletov nukleotidov kodirajo za 20 aminokislin, zato te aminokisline imenujemo standardne ali proteinogene [1]. Kljub temu v naravi obstajajo tudi selenoproteini, to so proteini, ki v svojem zaporedju vsebujejo aminokislino, imenovano selenocistein (Sec), ki ne sodi med 20 standardnih aminokislin. Zato se pojavi vprašanje, kako se med translacijo v polipeptidno verigo vključi selenocistein, če zanj ni kodona? V naravi je Sec kodiran s kodonom UGA, ki je stop kodon. Da se zagotovi prevod kodona UGA v Sec, namesto v stop kodon, ima ta stop kodon na 3’ koncu dodano od 20 do 60 nukleotidov dolgo specializirano zaporedje, imenovano SECIS (vstavitveno zaporedje za selenocistein) [2]. SECIS element omogoča mRNA selenoproteinov, da rekrutirajo elongacijski faktor SelB, ki se nato veže na specializirani tRNA<sup>Sec</sup>, ki prinaša Sec na aktivno mesto ribosoma. Ker selenoproteini kažejo višje katalitične hitrosti in odpornost proti nepovratni oksidaciji, kar omogoča Sec-vsebujočim proteinom hitrejše in daljše delovanje v primerjavi s Cys-vsebujočimi analogi, je sinteza načrtovanih selenoproteinov privlačna smer sintezne biologije [3]. Poznanih je že več strategij za sintezo selenoproteinov, vendar imajo nekatere pomanjkljivosti, saj zahtevajo dragocene in časovno zahtevne, včasih tudi nemogoče spremembe genetskega koda po celotnem genomu. Zato v članku A. Thaenert in sod. poročajo o novem pristopu k inženiringu ribosoma za sintezo načrtovanih selenoproteinov, ki temelji na fuziji med mRNA in ribosomom [4].


==Rezultati in diskusija==
==Rezultati in diskusija==
Line 11: Line 11:
V izhodiščnem članku so A. Thaenert in sod. želeli ustvariti ribosome, ki bi lahko v bakterijskih celicah vgradili selenocistein (Sec) na določenem mestu tarčnega proteina. Ker zaporedja SECIS rekrutirajo potrebne komponente za sintezo selenoproteinov k naravnim SECIS-mRNA, so domnevali, da vstavljanje SECIS elementa v rRNA lahko proizvede ribosome, ki so trajno povezani s kompleksom za sintezo selenoproteinov. Pričakovali so, da bo ta povezava omogočila ribosomom prevajanje UAG kodonov v Sec, namesto v stop kodon.
V izhodiščnem članku so A. Thaenert in sod. želeli ustvariti ribosome, ki bi lahko v bakterijskih celicah vgradili selenocistein (Sec) na določenem mestu tarčnega proteina. Ker zaporedja SECIS rekrutirajo potrebne komponente za sintezo selenoproteinov k naravnim SECIS-mRNA, so domnevali, da vstavljanje SECIS elementa v rRNA lahko proizvede ribosome, ki so trajno povezani s kompleksom za sintezo selenoproteinov. Pričakovali so, da bo ta povezava omogočila ribosomom prevajanje UAG kodonov v Sec, namesto v stop kodon.


Da bi preverili to idejo, so uporabili znano strukturo ribosoma E. coli, vezanega na protein SelB in mRNA, ki vsebuje SECIS. Struktura je pokazala, da se med naravno sintezo selenoproteinov tako SECIS kot SelB vežeta na ribosom v tesni bližini heliksa 16 (h16) 16S rRNA. Zato so h16 uporabili kot mesto za vstavljanje zaporedja SECIS in proizvedli fuzijske molekule SECIS–16S rRNA. Pripravili so različne fuzijske molekule, ki so se razlikovale v dolžini povezovalnih zaporedij, preko katerih je bil element SECIS kovalentno povezan s h16, in v mestu vstavitve, torej za katerim nukleotidom je bil element vstavljen. Zaporedje SECIS, ki so ga uporabili, je bilo minimalno funkcionalno zaporedje SECIS iz mRNA selenoproteina format dehidrogenaze (FDH) iz bakterije E. coli. Prav tako so mutirali proti-Shine-Dalgarnovo zaporedje (anti-SD) v fuzijskih molekulah, da bi zagotovili vezavo le na rekombinantno pripravljene in ne na naravne mRNA molekule. Te modificirane fuzijske molekule so poimenovali variante RiboU, kar pomeni, da lahko prevajajo stop kodone v Sec, ki mu pripada enočrkovna oznaka "U". Tako so ustvarili knjižnico, ki je vsebovala 32 različnih variant in vsaka varianta je bila nato vstavljena v plazmid za nadaljnje študije in izboljšave [4].
Da bi preverili to idejo, so uporabili znano strukturo ribosoma <em>E. coli</em>, vezanega na protein SelB in mRNA, ki vsebuje SECIS. Struktura je pokazala, da se med naravno sintezo selenoproteinov tako SECIS kot SelB vežeta na ribosom v tesni bližini heliksa 16 (h16) 16S rRNA. Zato so h16 uporabili kot mesto za vstavljanje zaporedja SECIS in proizvedli fuzijske molekule SECIS–16S rRNA. Pripravili so različne fuzijske molekule, ki so se razlikovale v dolžini povezovalnih zaporedij, preko katerih je bil element SECIS kovalentno povezan s h16, in v mestu vstavitve, torej za katerim nukleotidom je bil element vstavljen. Zaporedje SECIS, ki so ga uporabili, je bilo minimalno funkcionalno zaporedje SECIS iz mRNA selenoproteina format dehidrogenaze (FDH) iz bakterije <em>E. coli</em>. Prav tako so mutirali proti-Shine-Dalgarnovo zaporedje (anti-SD) v fuzijskih molekulah, da bi zagotovili vezavo le na rekombinantno pripravljene in ne na naravne mRNA molekule. Te modificirane fuzijske molekule so poimenovali variante RiboU, kar pomeni, da lahko prevajajo stop kodone v Sec, ki mu pripada enočrkovna oznaka "U". Tako so ustvarili knjižnico, ki je vsebovala 32 različnih variant in vsaka varianta je bila nato vstavljena v plazmid za nadaljnje študije in izboljšave [4].


===Vzpostavitev eksperimentalnega sistema za testiranje aktivnosti RiboU===
===Vzpostavitev eksperimentalnega sistema za testiranje aktivnosti RiboU===


Da bi preizkusili, ali lahko RiboU sintetizira selenoproteine v E. coli, so ustvarili sistem, ki temelji na specifičnem genu in modificiranem sevu E. coli. Kot izhodiščni gen so izbrali gen fdhF, ki kodira selenoprotein FDH, katerega aktivnost je odvisna od Sec ostanka na položaju 140 in ki jo je lahko enostavno meriti in vivo. Gen so modificirali tako, da so odstranili naravno zaporedje SECIS in spremenili Sec kodon (UGA) v stop kodon (UAG), nato pa prilagodili Shine–Dalgarnovo zaporedje (SD), da se ujema z zaporedjem v RiboU. Ta modificiran gen so nato vstavili v plazmid skupaj z genom selC, ki kodira za tRNASec, modificiran tako, da prepozna UAG kodone namesto UGA kodone. Uporabili so sev E. coli, imenovan C321, pri katerem so vsi naravni UAG kodoni spremenjeni v UAA stop kodone, in ga modificirali tako, da so odstranili naravne kopije genov fdhF in selC, da bi preprečili FDH aktivnost v ozadju. Nato so te celice kotransformirali s plazmidi, ki vsebujejo različne variante RiboU in modificirane gene fdhF in selC. Eksperimenti so pokazali, da je 24 od 32 variant RiboU lahko proizvedlo FDH z različno učinkovitostjo. To nakazuje, da lahko ribosomi v fuziji z zaporedjem SECIS tvorijo funkcionalne selenoproteine iz mRNA molekul, ki jim manjka zaporedje SECIS [4].
Da bi preizkusili, ali lahko RiboU sintetizira selenoproteine v <em>E. coli</em>, so ustvarili sistem, ki temelji na specifičnem genu in modificiranem sevu <em>E. coli</em>. Kot izhodiščni gen so izbrali gen fdhF, ki kodira selenoprotein FDH, katerega aktivnost je odvisna od Sec ostanka na položaju 140 in ki jo je lahko enostavno meriti <em>in vivo</em>. Gen so modificirali tako, da so odstranili naravno zaporedje SECIS in spremenili Sec kodon (UGA) v stop kodon (UAG), nato pa prilagodili Shine–Dalgarnovo zaporedje (SD), da se ujema z zaporedjem v RiboU. Ta modificiran gen so nato vstavili v plazmid skupaj z genom selC, ki kodira za tRNA<sup>Sec</sup>, modificiran tako, da prepozna UAG kodone namesto UGA kodone. Uporabili so sev <em>E. coli</em>, imenovan C321, pri katerem so vsi naravni UAG kodoni spremenjeni v UAA stop kodone, in ga modificirali tako, da so odstranili naravne kopije genov fdhF in selC, da bi preprečili FDH aktivnost v ozadju. Nato so te celice kotransformirali s plazmidi, ki vsebujejo različne variante RiboU in modificirane gene fdhF in selC. Eksperimenti so pokazali, da je 24 od 32 variant RiboU lahko proizvedlo FDH z različno učinkovitostjo. To nakazuje, da lahko ribosomi v fuziji z zaporedjem SECIS tvorijo funkcionalne selenoproteine iz mRNA molekul, ki jim manjka zaporedje SECIS [4].


===Izboljšanje aktivnosti RiboU s spremembo mesta vnosa zaporedja SECIS in dodajanjem mutacij v 16S rRNA===
===Izboljšanje aktivnosti RiboU s spremembo mesta vnosa zaporedja SECIS in dodajanjem mutacij v 16S rRNA===
Line 29: Line 29:
Nadaljevali so s preizkušanjem aktivnosti RiboU z uporabo sistema, ki bolj natančno odraža proizvodnjo rekombinantnih selenoproteinov. Uporabili so reporterje na osnovi inteinov, ki tvorijo neaktivni prekurzor reporterskega proteina, ki postane aktiven s samoizrezovanjem. V protein, ki zagotavlja odpornost proti kanamicinu (KanR), so vstavili intein imenovan DnaB, ki za svoje samoizrezovanje potrebuje N-terminalni Cys ali Sec ostanek. To jim je omogočilo zaznavanje prisotnosti Sec z merjenjem odpornosti na kanamicin. Sprva njihovi eksperimenti niso pokazali pomembnih sprememb v odpornosti na kanamicin pri izražanju RiboU, kar kaže, da njihov konstrukt RiboU ni bil primeren za sintezo selenoproteinov v večjem obsegu.  
Nadaljevali so s preizkušanjem aktivnosti RiboU z uporabo sistema, ki bolj natančno odraža proizvodnjo rekombinantnih selenoproteinov. Uporabili so reporterje na osnovi inteinov, ki tvorijo neaktivni prekurzor reporterskega proteina, ki postane aktiven s samoizrezovanjem. V protein, ki zagotavlja odpornost proti kanamicinu (KanR), so vstavili intein imenovan DnaB, ki za svoje samoizrezovanje potrebuje N-terminalni Cys ali Sec ostanek. To jim je omogočilo zaznavanje prisotnosti Sec z merjenjem odpornosti na kanamicin. Sprva njihovi eksperimenti niso pokazali pomembnih sprememb v odpornosti na kanamicin pri izražanju RiboU, kar kaže, da njihov konstrukt RiboU ni bil primeren za sintezo selenoproteinov v večjem obsegu.  


Da bi konstrukt izboljšali, so izvedli tri prilagoditve. Prvič so prenesli rRNA-SECIS fuzijsko zaporedje v plazmid z večjim številom kopij, pri čemer so ciljali na 15 do 20 kopij na celico. Drugič so zamenjali originalni promotor (promotor, induciran s anhidrotetraciklinom) s promotorjem, induciran z arabinozo, saj je ta manj toksična molekula. Nazadnje so zamenjali  E. coli sev BW25113 z B-95.ΔAΔfabR, ki ima izbit gen za RF1. Po teh spremembah so opazili izrazit porast odpornosti na kanamicin (do 75 μg/mL) ob izražanju RiboU, kar kaže na signifikantno proizvodnjo aktivnega reporterskega selenoproteina [4].
Da bi konstrukt izboljšali, so izvedli tri prilagoditve. Prvič so prenesli rRNA-SECIS fuzijsko zaporedje v plazmid z večjim številom kopij, pri čemer so ciljali na 15 do 20 kopij na celico. Drugič so zamenjali originalni promotor (promotor, induciran s anhidrotetraciklinom) s promotorjem, induciran z arabinozo, saj je ta manj toksična molekula. Nazadnje so zamenjali  <em>E. coli</em> sev BW25113 z B-95.ΔAΔfabR, ki ima izbit gen za RF1. Po teh spremembah so opazili izrazit porast odpornosti na kanamicin (do 75 μg/mL) ob izražanju RiboU, kar kaže na signifikantno proizvodnjo aktivnega reporterskega selenoproteina [4].


===Masna spektrometrija potrjuje mestno-specifičen vnos ostanka Sec v rekombinantni tarčni protein z RiboU===
===Masna spektrometrija potrjuje mestno-specifičen vnos ostanka Sec v rekombinantni tarčni protein z RiboU===


V končnem poskusu so preizkusili sposobnost variante RiboU-v24-419-OR1, da na specifičnih mestih vstavi Sec ostanke v polipeptidno verigo. Kot model selenoproteina so uporabili majhen protein glutation oksidoreduktazo iz E. coli (Grx1). Grx1 lahko kot katalitičen ostanek v aktivnem mestu vsebuje bodisi Cys11 ali Sec11, pri čemer mutacije v Ser11 naredijo protein neaktiven. Ustvarili so tri variante Grx1: Grx1(C11) kot pozitivno kontrolo, Grx1(S11) kot negativno kontrolo in Grx1(UAG11) kot reporter za merjenje vstavljanja Sec s pomočjo RiboU. Variante so bile proizvedene v celicah B-95.ΔAΔfabR, ki izražajo RiboU-v24-419-OR1, nato pa so reporterske proteine izolirali za analizo. Preizkusi encimske aktivnosti so pokazali, da je Grx1(Ser11) neaktiven, medtem ko sta Grx1(C11) in Grx1(U11) pokazala podobne ravni aktivnosti.
V končnem poskusu so preizkusili sposobnost variante RiboU-v24-419-OR1, da na specifičnih mestih vstavi Sec ostanke v polipeptidno verigo. Kot model selenoproteina so uporabili majhen protein glutation oksidoreduktazo iz <em>E. coli</em> (Grx1). Grx1 lahko kot katalitičen ostanek v aktivnem mestu vsebuje bodisi Cys11 ali Sec11, pri čemer mutacije v Ser11 naredijo protein neaktiven. Ustvarili so tri variante Grx1: Grx1(C11) kot pozitivno kontrolo, Grx1(S11) kot negativno kontrolo in Grx1(UAG11) kot reporter za merjenje vstavljanja Sec s pomočjo RiboU. Variante so bile proizvedene v celicah B-95.ΔAΔfabR, ki izražajo RiboU-v24-419-OR1, nato pa so reporterske proteine izolirali za analizo. Preizkusi encimske aktivnosti so pokazali, da je Grx1(Ser11) neaktiven, medtem ko sta Grx1(C11) in Grx1(U11) pokazala podobne ravni aktivnosti.


Analiza masne spektrometrije je potrdila vstavljanje Sec na specifično mesto v Grx1(UAG11), pri čemer je bil Sec11 prisoten v 34,4 % proteinov, medtem ko je v preostalih 65,6 % UAG11 bil preveden kot Gln, Tyr in Ser. Preostanek Grx1(UAG11), ki vsebuje Ser11, kaže na nepopolno pretvorbo Ser-tRNASec v Sec-tRNASec. Ti rezultati so pokazali, da nepopolni RiboU omogoča natančno in specifično vključevanje Sec v rekombinantne proteine, proizvedene v celicah E. coli [4].
Analiza masne spektrometrije je potrdila vstavljanje Sec na specifično mesto v Grx1(UAG11), pri čemer je bil Sec11 prisoten v 34,4 % proteinov, medtem ko je v preostalih 65,6 % UAG11 bil preveden kot Gln, Tyr in Ser. Preostanek Grx1(UAG11), ki vsebuje Ser11, kaže na nepopolno pretvorbo Ser-tRNA<sup>Sec</sup> v Sec-tRNA<sup>Sec</sup>. Ti rezultati so pokazali, da nepopolni RiboU omogoča natančno in specifično vključevanje Sec v rekombinantne proteine, proizvedene v celicah <em>E. coli</em> [4].


==Zaključek==
==Zaključek==

Latest revision as of 10:20, 5 May 2024

Izhodiščni članek: Engineered mRNA–ribosome fusions for facile biosynthesis of selenoproteins

Uvod

V genetskem kodu, kot ga poznamo, vse možne kombinacije tripletov nukleotidov kodirajo za 20 aminokislin, zato te aminokisline imenujemo standardne ali proteinogene [1]. Kljub temu v naravi obstajajo tudi selenoproteini, to so proteini, ki v svojem zaporedju vsebujejo aminokislino, imenovano selenocistein (Sec), ki ne sodi med 20 standardnih aminokislin. Zato se pojavi vprašanje, kako se med translacijo v polipeptidno verigo vključi selenocistein, če zanj ni kodona? V naravi je Sec kodiran s kodonom UGA, ki je stop kodon. Da se zagotovi prevod kodona UGA v Sec, namesto v stop kodon, ima ta stop kodon na 3’ koncu dodano od 20 do 60 nukleotidov dolgo specializirano zaporedje, imenovano SECIS (vstavitveno zaporedje za selenocistein) [2]. SECIS element omogoča mRNA selenoproteinov, da rekrutirajo elongacijski faktor SelB, ki se nato veže na specializirani tRNASec, ki prinaša Sec na aktivno mesto ribosoma. Ker selenoproteini kažejo višje katalitične hitrosti in odpornost proti nepovratni oksidaciji, kar omogoča Sec-vsebujočim proteinom hitrejše in daljše delovanje v primerjavi s Cys-vsebujočimi analogi, je sinteza načrtovanih selenoproteinov privlačna smer sintezne biologije [3]. Poznanih je že več strategij za sintezo selenoproteinov, vendar imajo nekatere pomanjkljivosti, saj zahtevajo dragocene in časovno zahtevne, včasih tudi nemogoče spremembe genetskega koda po celotnem genomu. Zato v članku A. Thaenert in sod. poročajo o novem pristopu k inženiringu ribosoma za sintezo načrtovanih selenoproteinov, ki temelji na fuziji med mRNA in ribosomom [4].

Rezultati in diskusija

Načrtovanje ribosomov za biosintezo selenoproteinov

V izhodiščnem članku so A. Thaenert in sod. želeli ustvariti ribosome, ki bi lahko v bakterijskih celicah vgradili selenocistein (Sec) na določenem mestu tarčnega proteina. Ker zaporedja SECIS rekrutirajo potrebne komponente za sintezo selenoproteinov k naravnim SECIS-mRNA, so domnevali, da vstavljanje SECIS elementa v rRNA lahko proizvede ribosome, ki so trajno povezani s kompleksom za sintezo selenoproteinov. Pričakovali so, da bo ta povezava omogočila ribosomom prevajanje UAG kodonov v Sec, namesto v stop kodon.

Da bi preverili to idejo, so uporabili znano strukturo ribosoma E. coli, vezanega na protein SelB in mRNA, ki vsebuje SECIS. Struktura je pokazala, da se med naravno sintezo selenoproteinov tako SECIS kot SelB vežeta na ribosom v tesni bližini heliksa 16 (h16) 16S rRNA. Zato so h16 uporabili kot mesto za vstavljanje zaporedja SECIS in proizvedli fuzijske molekule SECIS–16S rRNA. Pripravili so različne fuzijske molekule, ki so se razlikovale v dolžini povezovalnih zaporedij, preko katerih je bil element SECIS kovalentno povezan s h16, in v mestu vstavitve, torej za katerim nukleotidom je bil element vstavljen. Zaporedje SECIS, ki so ga uporabili, je bilo minimalno funkcionalno zaporedje SECIS iz mRNA selenoproteina format dehidrogenaze (FDH) iz bakterije E. coli. Prav tako so mutirali proti-Shine-Dalgarnovo zaporedje (anti-SD) v fuzijskih molekulah, da bi zagotovili vezavo le na rekombinantno pripravljene in ne na naravne mRNA molekule. Te modificirane fuzijske molekule so poimenovali variante RiboU, kar pomeni, da lahko prevajajo stop kodone v Sec, ki mu pripada enočrkovna oznaka "U". Tako so ustvarili knjižnico, ki je vsebovala 32 različnih variant in vsaka varianta je bila nato vstavljena v plazmid za nadaljnje študije in izboljšave [4].

Vzpostavitev eksperimentalnega sistema za testiranje aktivnosti RiboU

Da bi preizkusili, ali lahko RiboU sintetizira selenoproteine v E. coli, so ustvarili sistem, ki temelji na specifičnem genu in modificiranem sevu E. coli. Kot izhodiščni gen so izbrali gen fdhF, ki kodira selenoprotein FDH, katerega aktivnost je odvisna od Sec ostanka na položaju 140 in ki jo je lahko enostavno meriti in vivo. Gen so modificirali tako, da so odstranili naravno zaporedje SECIS in spremenili Sec kodon (UGA) v stop kodon (UAG), nato pa prilagodili Shine–Dalgarnovo zaporedje (SD), da se ujema z zaporedjem v RiboU. Ta modificiran gen so nato vstavili v plazmid skupaj z genom selC, ki kodira za tRNASec, modificiran tako, da prepozna UAG kodone namesto UGA kodone. Uporabili so sev E. coli, imenovan C321, pri katerem so vsi naravni UAG kodoni spremenjeni v UAA stop kodone, in ga modificirali tako, da so odstranili naravne kopije genov fdhF in selC, da bi preprečili FDH aktivnost v ozadju. Nato so te celice kotransformirali s plazmidi, ki vsebujejo različne variante RiboU in modificirane gene fdhF in selC. Eksperimenti so pokazali, da je 24 od 32 variant RiboU lahko proizvedlo FDH z različno učinkovitostjo. To nakazuje, da lahko ribosomi v fuziji z zaporedjem SECIS tvorijo funkcionalne selenoproteine iz mRNA molekul, ki jim manjka zaporedje SECIS [4].

Izboljšanje aktivnosti RiboU s spremembo mesta vnosa zaporedja SECIS in dodajanjem mutacij v 16S rRNA

V nadaljevanju so želeli preveriti, ali lahko delovanje RiboU izboljšajo tako, da poiščejo boljše mesto za vstavljanje SECIS v 16S rRNA, zato so preizkusili šest različnih mest v h16. Ko so vstavili SECIS med bazama 419 in 420 ali med 420 in 421, so variante RiboU pokazale približno petkrat višjo aktivnost v primerjavi z originalno verzijo (RiboU-v24-424-OR2). Nato so izbrali eno od novih variant RiboU (RiboU-v24-419-OR2) za nadaljnje izboljšave, kar kaže, da izbira boljšega mesta za vstavljanje SECIS lahko bistveno poveča učinkovitost RiboU.

Nato so preiskali, ali lahko specifične mutacije v 16S rRNA še dodatno povečajo aktivnost RiboU. Prejšnje raziskave so nakazovale, da mutaciji C1100U in G1516U povečata sintezo naravnih selenoproteinov, medtem ko mutaciji U531G in U534A izboljšata sposobnost ribosoma za interpretacijo UAG kodonov kot smiselne kodone in zmanjšata njegovo afiniteto do sprostitvenega faktorja RF1, zaradi česa je RF1 manj konkurenčen tRNA za prepoznavanje UAG. Mutacije so vstavili v konstrukt RiboU-v24-419-OR2 in preučili njihov vpliv na sintezo selenoproteinov. Ugotovili so, da mutacija G1516U (in C1100U) ni povečala proizvodnje selenoproteinov, vendar pa sta mutaciji U531G in U534A povečali aktivnost RiboU za približno desetkrat. Tako izboljšanje so opazili tudi pri sevu brez RF1, kar kaže, da te mutacije lahko vplivajo na prepoznavanje UAG neodvisno od RF1.

Želeli so si tudi povečati proizvodnjo selenoproteinov z optimizacijo parov SD/anti-SD. Primerjali so tri alternative ortogonalnih parov SD/anti-SD in ugotovili, da je zamenjava OR2 z ortogonalnim zaporedjem SD/anti-SD OR1 povečala aktivnost FDH za tri rede velikosti. Posledično so razvili izboljšano različico RiboU-v24-419-OR1, ki presega prejšnji RiboU-v24-419-OR2 [4].

Povečano izražanje RiboU omogoča učinkovito sintezo rekombinantnih selenoproteinov

Nadaljevali so s preizkušanjem aktivnosti RiboU z uporabo sistema, ki bolj natančno odraža proizvodnjo rekombinantnih selenoproteinov. Uporabili so reporterje na osnovi inteinov, ki tvorijo neaktivni prekurzor reporterskega proteina, ki postane aktiven s samoizrezovanjem. V protein, ki zagotavlja odpornost proti kanamicinu (KanR), so vstavili intein imenovan DnaB, ki za svoje samoizrezovanje potrebuje N-terminalni Cys ali Sec ostanek. To jim je omogočilo zaznavanje prisotnosti Sec z merjenjem odpornosti na kanamicin. Sprva njihovi eksperimenti niso pokazali pomembnih sprememb v odpornosti na kanamicin pri izražanju RiboU, kar kaže, da njihov konstrukt RiboU ni bil primeren za sintezo selenoproteinov v večjem obsegu.

Da bi konstrukt izboljšali, so izvedli tri prilagoditve. Prvič so prenesli rRNA-SECIS fuzijsko zaporedje v plazmid z večjim številom kopij, pri čemer so ciljali na 15 do 20 kopij na celico. Drugič so zamenjali originalni promotor (promotor, induciran s anhidrotetraciklinom) s promotorjem, induciran z arabinozo, saj je ta manj toksična molekula. Nazadnje so zamenjali E. coli sev BW25113 z B-95.ΔAΔfabR, ki ima izbit gen za RF1. Po teh spremembah so opazili izrazit porast odpornosti na kanamicin (do 75 μg/mL) ob izražanju RiboU, kar kaže na signifikantno proizvodnjo aktivnega reporterskega selenoproteina [4].

Masna spektrometrija potrjuje mestno-specifičen vnos ostanka Sec v rekombinantni tarčni protein z RiboU

V končnem poskusu so preizkusili sposobnost variante RiboU-v24-419-OR1, da na specifičnih mestih vstavi Sec ostanke v polipeptidno verigo. Kot model selenoproteina so uporabili majhen protein glutation oksidoreduktazo iz E. coli (Grx1). Grx1 lahko kot katalitičen ostanek v aktivnem mestu vsebuje bodisi Cys11 ali Sec11, pri čemer mutacije v Ser11 naredijo protein neaktiven. Ustvarili so tri variante Grx1: Grx1(C11) kot pozitivno kontrolo, Grx1(S11) kot negativno kontrolo in Grx1(UAG11) kot reporter za merjenje vstavljanja Sec s pomočjo RiboU. Variante so bile proizvedene v celicah B-95.ΔAΔfabR, ki izražajo RiboU-v24-419-OR1, nato pa so reporterske proteine izolirali za analizo. Preizkusi encimske aktivnosti so pokazali, da je Grx1(Ser11) neaktiven, medtem ko sta Grx1(C11) in Grx1(U11) pokazala podobne ravni aktivnosti.

Analiza masne spektrometrije je potrdila vstavljanje Sec na specifično mesto v Grx1(UAG11), pri čemer je bil Sec11 prisoten v 34,4 % proteinov, medtem ko je v preostalih 65,6 % UAG11 bil preveden kot Gln, Tyr in Ser. Preostanek Grx1(UAG11), ki vsebuje Ser11, kaže na nepopolno pretvorbo Ser-tRNASec v Sec-tRNASec. Ti rezultati so pokazali, da nepopolni RiboU omogoča natančno in specifično vključevanje Sec v rekombinantne proteine, proizvedene v celicah E. coli [4].

Zaključek

V študiji so A. Thaenert in sod. predstavili RiboU, ki predstavlja strategijo modificiranja ribosoma, ki omogoča vstavljanje selenocisteina na specifična mesta v tarčne proteine brez potrebe po spreminjanju kodonov po celem genomu. Z integracijo zaporedja SECIS v 16S rRNA lahko RiboU prevaja UAG kodone kot Sec in razširi sposobnosti sinteze selenoproteinov. Čeprav trenutne variante RiboU kažejo nekaj omejitev v učinkovitosti, predstavljajo pomemben napredek pri uporabi inženiringa ribosoma za namene sintezne biologije. Prihodnje izboljšave, kot so izboljšanje natančnosti vstavljanja Sec in povečanje izkoristkov proteinov, imajo potencial za nadaljnji razvoj te tehnologije. Opisan inovativen pristop poudarja potencial združevanja rRNA z regulatornimi elementi mRNA za spreminjanje interpretacije genetskega koda, kar obeta visoka pričakovanja v biotehnologiji in znanstvenem raziskovanju [4].

Literatura

[1] Genetic Code | Definition, Characteristics, Table, & Facts | Britannica. 5 Apr. 2024, https://www.britannica.com/science/genetic-code.

[2] Berry, Maria J., et al. “Recognition of UGA as a Selenocysteine Codon in Type I Deiodinase Requires Sequences in the 3′ Untranslated Region.” Nature, vol. 353, no. 6341, Sept. 1991, pp. 273–76. www.nature.com, https://doi.org/10.1038/353273a0.

[3] Stock, Tilmann, and Michael Rother. “Selenoproteins in Archaea and Gram-Positive Bacteria.” Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects, vol. 1790, no. 11, Nov. 2009, pp. 1520–32. ScienceDirect, https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2009.03.022.

[4] Thaenert, Anna, et al. “Engineered mRNA–Ribosome Fusions for Facile Biosynthesis of Selenoproteins.” Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 121, no. 11, Mar. 2024, p. e2321700121. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1073/pnas.2321700121.

Retrieved from "https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Inženirane_mRNA-ribosomske_fuzije_za_lažjo_biosintezo_selenoproteinov&oldid=23369"