Epigenetska regulacija celičnega cikla

1.CELIČNI CIKEL

Celica se razmnožuje z izvajanjem urejenega zaporedja dogodkov pri čemer podvoji svojo vsebino in se nato deli v dve celici. Ta cikel podvajanja in delitve, imenovan celični cikel[[1]], je bistven mehanizem s pomočjo katerega se razmnožujejo vsa živa bitja. Pri evkariontskih celicah je celični cikel razdeljen na 4 faze. Pod mikroskopom je najbolj zanimiva M faza v kateri pride do mitoze in citokineze. Čas med eno in drugo M fazo se imenuje interfaza. Sestavljajo jo S faza, G1 faza ter G2 faza. Med S fazo celica podvoji svojo jedrno DNA , kar je bistveno za celično delitev.

2.EPIGENETSKO DEDOVANJE MED CELIČNIM CIKLOM

V zadnjih letih je prišlo do velikega napredka na področju identifikacije ključnih kandidatov za epigenetske označevalce in mehanizmov, ki zagotavljajo njihovo dedovanje in reverzibilnost. Sedaj je jasno, da pri replikacijskih vilicah[[2]] delujejo kompleksni mehanizmi, ki zagotavljajo epigenetsko dedovanje:

• metilacije DNA
• DNA in kromatin vezajočih faktorjev
• modifikacij histonov ter drugih faktorjev, ki prispevajo k visoki organiziranosti struktur.

Poleg tega so ugotovili, da niso vsi markerji neposredno vključeni v procese replikacijskih vilic, saj je kromatin podvržen tudi procesom, ki niso povezani z procesom replikacije . Določene variante histonov (npr.CENP-A) se dedujejo na način neodvisen od replikacije, kar kaže na pomebnost ostalih faz celičnega cikla (ne zgolj S faze).

V vsakem ceilčnem ciklu je celovitost genetske in epigentske informacije testirana med procesom podvajanja DNA. Ta proces predstavlja tudi možnost za spremebe epigenetskih stanj med diferenciacijo in razvojem. V ta namen so se razvili precizni mehanizmi, ki zagotavljajo stabilnost med prenosom genetske in epigentske informacije v replikacijskih vilicah ter omogočajo možnost želenih zamenjav med razvojem.

2.1Dedovanje metilacije DNA med podvajanjem

Replikacija DNA poteka asimetrično , z neprekinjeno sintezo na vodilni verigi ter prekinjeno na zastajajoči verigi. Sinteza je katalizirana s pomočjo DNA polimeraze na vsaki verigi.DNA polimerazi pri tem pomaga še proliferacijski celični jedrni antigen (proliferating cell nuclear antigen- PCNA), ki je naložen na obe verigi. Na ta način PCNA služi kot pomembna povezava med verigama in zvijanje verig v prostoru zagotavlja sklopitev replikacijskega mehanzma na obeh verigah. Poleg vloge v DNA sintezi, naj bi PCNA tudi povezoval DNA sintezo in dedovanje epigenetskih markerjev ter interagiral s faktorji, ki sodelujejo pri modificiranju in sestavljanju kromatina. Poleg PCNA so še drugi faktorji, ki prispevajo k povezavi med dedovanjem genetske in epigentske informacije:

• MCM kompleks:

Mini kromosom vzdrževalni kompleks, je domnevno replikativna helikaza, ki interagira z histon-šaperon anti-silencing funkcijo 1, kar naj bi koordiniralo tok histonov med starševskimi in hčerinskimi verigami.

• DNMT1:

DNA metiltransferaza 1, služi vzdrževanju metilacije DNA na replikacijskih vilicah ter interagira z PCNA. (zaporedja simetrične metilacije DNA na CpG (citozin, ki mu sledi gvanin)mestih)[[3]]

• NP95(imenovan tudi UHRF1):

Protein pri sesalcih, ki predstavlja dodatno mehansko povezavo med delno metilirano DNA in DNMT1(veže se na DNA ter interagira z DNMT1).Posledica odstranitve NP95 so metilacijski defekti, ki spominjajo na tiste, ki jih lahko opazimo pri izgubi DNMT1, kar nakazuje na pomembno vlogo NP95 pri vzdrževanju metiltransferazne aktivnosti pravkar podvojene DNA.[[4]]

Vzorci metilacije DNA se lahko zvesto reproducirajo (po prehodu replikacijskih vilic) z izkoriščanjem več dejavnikov: semi-konzervativno podvajanje, posledica je delno metilirana DNA, prepoznavanje te delno metilirane hčerinske verige s strani NP95 ter povezava DNMT1 z replikacijskim mehanizmom.

2.2Dedovanje histonov in njihovih modifikacij

DNA in njeni metilacijski markerji se podvajajo s pomočjo semi-konzervativnega mehanizma, pri čemer je informacija kopirana iz predloge. Prehod replikacijskih vilic poruši starševski nukleosom, ki nosi post-translacijske modifikacije. Da bi bili dedni in s tem epigenetski markerji, morajo biti ti histoni in njihove modifikacije ponovno sestavljeni za replikacijskimi vilicami. Vendar logične predloge za ponovno sestavo nukleosoma ni. Glede na to, da je zunaj S faze zamenjava replikativnih histonov H3(varianta H3.1) in H4 minimalna v primerjavi s hitro zamenjavo H2A in H2B, sta histona H3 in H4 ter njuni markerji najbolj verjetna kandidata, za prenašanje informacije iz enega celičnega cikla do drugega. Torej, da bi se izognili izgubi informacije , ki je zakodirana v histonskih modifikacijah, je potrebna pravilna koordinacija med reciklirajočimi starševskimi H3-H4 dimeri in njihovimi histonskimi markerji skupaj z novo nastalimi histoni.Kako to poteka opisuje več različnih domnevnih modelov, ki so predmet trenutnih raziskav.

2.3Povezava dedovanja DNA in histonskih markerjev

Pri modelu bralec-pisec dedovanj histonskih markerjev, služijo markerji na sosednjih starševskih nukleosomih kot podlaga za modifikacije novo vključenih histonov. Do tega koraka naj bi prišlo v kasnejših fazah celičnega cikla.

Prav tako pa bi markerji lahko bili uvedeni replikacijsko in naj bi bili koordinirani z začetkom replikacije domen. Pri tem načinu naj bi bili dve možnosti:

• skupni faktorji na vseh replikacijskih vilicah, ki vplivajo na označevanje
• domensko specifični faktorji, ki so nadzorovani preko lokalnega kromatinskega okolja in preko že obstoječih markerjev, kot je npr. metilacija DNA

Ti modeli in domneve so še precej nejasni in potrebni nadaljnih raziskav ter študij.

2.4Dedovanje histonskih variacij izven S faze

Histonske variante lahko označujejo stanje kromatina. Aktivne regije so obogatene s H3.3, medtem, ko edinstvena vključitev centromer specifičnega histona H3 ((varianta CenH3, CENP-A pri ljudeh[[5]]) določa mesto centromerne identitete. Skupaj z replikativnima variantama H3.1 ter H3.2, nadomestni varianti H3.3 in CENP-A predstavljata glavni H3 histoski izotip pri sesalcih. Med S fazo se vkjučujeta izkjučno H3.1 ter H3.2, medtem, ko do odlaganja nadomestnih variant H3.3 in CENP-A prihaja izven S faze. Zaradi tega ti dve histonski varianti predstavljata glavna kandidata pri prenosu epigentske informacije izven procesa replikacije.

3.KLJUČNI EPIGENETSKI MEHANIZMI V BAKTERIJSKIH CELICAH

DNA metilacija je najbolj znacilen epigenetski postopek v celicah, tako pri evkariontih kakor tudi pri prokariontih. Pri obeh vrstah celice najdemo metilno skupino na citozinu (5. atom ogljika), ter na adeninu (na 4. atomu dušika). Pri bakterijskih celicah pa je prisotna še metilizacija citozina in sicer na 4. atomu dušika. N6-metil-adenin je prisoten, ko regulatorni proteini lahko reagirajo z DNA, saj znižuje termodinamsko stabilnost in spremeni ukrivljenost DNA .

3.1DNA adenin metiltransferaza pri γ-proteobakterijah

DAM encim ima 2 domeni, donorska skupina preko metionina prinaša metilno skupino, druga domena pa se veže na DNA. Encim se veže na nemetilirane in polmetilirane GATC-sekvence. DAM regulira celicni cikel pri posameznih vrstah bakterij, kot je naprimer Vibrio cholerae[[6]], medtem ko je pri nekaterih drugih vrstah (npr. E.coli[[7]]) prisoten ni pa nujen za preživetje. Ob odsotnosti DAM se številni geni narobe izražajo. Da pa se metilirajo le želeni deli bakterijske DNA poskrbita proteina Lrp in OxyR, ki se vežeta na ista mesta kot DAM in tako inhibirata metilacijo ob prehodu skozi replikacijske vilice.

3.2CcrM metilaza pri α-bakterijah Prvic je bil identificiran pri C.crescentus[[8]]. Metilira GANTC zaporedje in ima pomembno vlogo pri celicni replikaciji. V celici se nahaja se le pred celicno delitvijo, kar sovpada s koncem podvajanja kromosoma. Zaporedje GANTC se skozi replikacijske vilice le napol metilira in ostane tako do celicne delitve.

3.3DnaA transkripcija v E.coli in v C.crescentus DnaA je replikacijski faktor z dvema vlogama, in sicer začne replikacijo DNA in je transkripcijski faktor. Promotorska regija DnaA vsebuje pri E.coli 6 GATC mest, pri C.crescendus pa 2 GANTC mesti. Pri obeh je izražanje gena za DnaA bolj intenzivno, če so promotorska mesta polno metilirana. Vzrok za to se ni povsem pojasnen, sklepa pa se, da je zato odgovoren YccV protein pri E.coli, ki preprečuje transkripcijo DnaA z direktno vezavo na delno metilirano DnaA promotorsko regijo. Pri C.crescentus je možen DnaA repressor GcrA protein.

N6-adenin metilacija je pomemben epigenetski dejavnik, ki regulira celični cikel bakterijske celice. Igra ključno vlogo pri kromosomski replikaciji. DnaA, CtrA in CcrM so regulatorji pri transkripciji okoli 200 genov ki so pomembni za celični cikel. V prihodnosti je potrebno raziskati, zakaj je CcrM potreben za preživetje γ -proteobakterije, prav tako je potrebno raziskati metilacijo GANTC sekvenci pri alfa-proteobakteriji.

4.PRIMER EPIGENETSKE REGULACIJE CELIČNEGA CIKLA

Epigenetska regulacija na področju celičnega cikla se smatra kot mehanizem za inaktivacijo poti za sintezo supresorjev tumorja v veliko primerih rakavih obolenj. Ena od teh obolenj je tudi osteosarkom[[9]].Osteosarkom je najpogostejši primarni maligni tumor na kosteh pri otrocih in mladostnikih. Ta tumor je povezan s spremembami v genih, ki so vključeni v regulacijo celičnega cikla in apoptozo.

Nedavni napredki na področju epigenetike so pripomogli k boljšemu razumevanju patogeneze osteosarkoma. Spreminjanje ekspresije genov in signalnih poti, ki nadzorujejo celični cikel in apoptozo lahko privede do spremembe normalne celice v maligno. Najbolj očitno vlogo pri nastanku osteosarkoma imata proteina p53 in retinoblastom (Rb)[[10]]. Vendar pa so bile raziskave osredotočene večinoma zgolj na mutacije in ne na epigenetskemehanizme pri inaktivaciji teh in drugih regulatorjev.

4.1Retinoblastom Rb je v mnogih tipih raka inaktiviran. Njegova vloga v celičnem ciklu je inhibicija vstopa v S-fazo. Genetske spremembe gena so večinoma delecije. Hipermetilacija gena za Rb vpliva na druge vrste raka, vendar glede na raziskave, na osteosarkom nima vpliva. Dokazano je bilo, da od Rb odvisna ustavitev G1 vključuje p16INK4A inhibicijo ciklinskih D/cdk4 in cdk6 kompleksov, ki ponavadi začnejo fosforilacijo Rb. Tako lahko spremembe v Rb, cdk4/6, ciklinu D ali p16INK4A vodijo do genetskih okvar, kar vodi do nastanka tumorja. Do nedavnega niso raziskovali epigenetskih modifikacij pk16INK4A gena, ki je pogosto spremenjen tumorski supresor v celičnih linijah z osteosarkomom, sedaj pa se je pokazalo, da ima metilacija promotorja za RB ali p16INK4A veliko vlogo v motenju kontrole celičnega cikla in nastanka osteosarkoma.

4.2Protein p53 P53 igra pomembno vlogo pri apoptozi, prekinitvi celičnega cikla in obnavljanju DNA. Ko pride do poškodbe DNA in ta ni popravljiva, začne p53 proces apoptoze. Če pa pride do hipermetilacije proteina HIC1 (kar se zgodi pri raku), se ta deaktivira, s tem pa se poveča konc. SIRT1 deacetilaze, ki deacetilira in inaktivira p53. Tako je apoptoza preprečena in celice s poškodovano DNA lahko preživijo, kar vodi do nastanka tumorjev. V patogenezo osteosarkoma je torej vključenih veliko poti, med katerimi so tudi poti celičnega cikla in apoptoze, ki imajo pomembno vlogo v tumorogenezi.

In čeprav vemo, da p53, Rb in ostali mediatorji regulacije celičnega cikla in apoptoze prispevajo k osteosarkomu, še ni čisto jasno, kako so ti geni spremenjeni. Vendar pa novejše študije kažejo na to, da bi lahko na te gene vplivali metilacija, modifikacije histonov in drugi epigenetski dejavniki.

5.VIRI

• Aline V. Probst, Elaine Dunleavy & Geneviève Almouzni; Epigenetic inheritance during the cell cycle; Nature Reviews Molecular Cell Biology 10, 192-206 (March 2009)[[11]]
• Collier J.; Epigenetic regulation of the bacterial cell cycle; Current Opinion Microbiology 2009 Dec;12(6):722-9[[12]]
• Krithi Rao-Bindal, Eugenie S. Kleinerman; Epigenetic Regulation of Apoptosis and Cell Cycle in Osteosarcoma; Sarcoma Volume 2011 (2011), Article ID 679457, 5 pagesdoi:10.1155/2011/679457[[13]]