Epigenetika in staranje

Epigenetika in staranje

Staranje lahko definiramo, kot kopico različnih sprememb nekega osebka skozi čas. Te spremembe so lahko psihološke fiziološke ali socialne in se lahko z leti, v procesu staranja, povečujejo ali zmanjšujejo. Na mikroskopski ravni se staranje pokaže z omejitvijo delitev vsake posamezne somatske celice. Takšno, celično staranje, povezujemo z telomernimi regijami. Telomerno regijo, ki jo vsebuje DNA, ponavadi najdemo na koncu linearnega evkariontskega kromosoma. V tem delu ni prisotnih genov. Njihova naloga je predvsem zaščita naravnih koncev kromosoma pred razgradnjo ali spojitvijo enega konca z drugim, odločajo pa tudi o celičnem preživetju ali smrti, njenem staranju in imajo pomembno vlogo pri rasti rakavih celic. Telomerne regije se z vsako delitvijo malo krajšajo – na ta račun izgubi celica približno 50-150 baznih parov. Ko se približamo genomu, se celica preneha deliti – takrat pravimo, da celica preide v obdobje replikativne stabilnosti. Med nesmrtne celice štejemo spolne in rakaste celice.

Telomere in telomeraza

Primarna struktura telomer sestoji iz kratke sekvence, bogate v gvaninih, in iz enoverižnega podaljška na 3' koncu. Za telomerne sekvence sesalcev je značilno zaporedje TTAGGG/CCCTTA. Dvoverižni del telomere je vezan na histonske in nehistonske proteinske komplekse. Eden izmed pomembnih nehistonskih proteinskih kompleksov je heksamerni protein shelterin oziroma telosom. Spremembe v strukturi ali kompoziciji kompleksa telosom-telomera imajo vpliv na delovanje telomer preko modifikacij dolžine ali strukture. Posttranslacijske modifikacije komponent telosoma, ki jih lahko štejemo med epigenetske spremembe, če so prisotne tako v parentalni kot v filialni generaciji, vplivajo na funkcijo telomer. Najbolj poznana posttranslacijska modifikacija je poli-ADP-ribozilacija proteina TRF1 (protein, ki veže dvoverižni del telomere in regulira njeno dolžino; ang: telomeric repeat binding factor-1). Proces poli-ADP-ribozilacije katalizira encim tankriaza (TNKS1; ang: tankryase). Encim se veže na telomerni protein TRF1, ki negativno vpliva na vzdrževanje telomerne dolžine – je njen negativni regulator. In vitro raziskave so pokazale, da ADP-ribozilacija TRF1 proteina zmanjša njegovo afiniteto za telomerno sekvenco DNA, kar pomeni, da je aktivnost oziroma funkcija telomeraze v človeških celicah regulirana s procesom poli-ADP-ribozilacije. Akumulacija TRF1 na dolge telomere, ki jo katalizira encim telomeraza, prepreči nadaljnjo elongacijo (preko aktivnosti POT1 komponente shelterina, ki veže G-rep). Prisotnost POT1 se zmanjša s krajšanjem G-repa na 3' koncu, na katerega se tudi veže. Vezavo POT1 na G-rep regulira TRF1 kompleks in sicer glede na dolžino G-repa. Njuna interakcija pa je pomembna tudi za telomerazo, saj se tako prenese informacija o dolžini telomere do regulatorne domene telomeraze.

Telomeraza je encim, ki dodaja zaporedja nukleotidov, bogatih v gvaninih, na 3' konec kromosoma in je specializiran kompleks reverzne transkriptaze. Do sedaj so bile odkrite štiri komponente telomeraze: katalitična domena hTERT; hTERTC, ki je RNA matrica, po kateri telomeraza dodaja nukleotide na 3' konec; pontin in reptin, ki pomagata združiti encim. Mutacije teh komponent so povezane z različnimi boleznimi kot je na primer Zinsser-Cole-Engman sindrom in številnimi drugimi somatskimi abnormalnostim vključno z zgodnjim sivenjem, izgubo zob, osteoporozo in povečana verjetnost pojave malignih (rakavih) tvorb. Njena aktivnost se zmanjša, ko se celica diferencira, in se reaktivira v skoraj vse rakastih celicah (nekatere izmed njih uporabljajo alternativni mehanizem ALT). Epigenetski procesi, ki kontrolirajo delovanje telomeraze so metilacija CpG otočkov, metilacija in acetilacija histonov, ter modifikacija histonov.

• V sekvenci genoma, natančneje na promotorskem mestu in na mestu prvega eksona, so značilne ponovitve CpG dinukleotidov, ki jim pravimo tudi CpG otočki. Metilacija CpG otočkov ponavadi zavira ekspresijo genov. Zanjo so odgovorni encimi DNA metiltransferaze. Znani so trije taki encimi, med katerimi prvi metilira citozin in je odgovoren za vzdrževanje metiliranih vzorcev medtem, ko druga dva metilirata de novo. V normalnih celicah CpG otočki ponavadi niso metilirani medtem, ko je znano, da se v rakastih celicah metilirajo, čeprav je nivo DNA metilacije nizek. DNA metilacija lahko sproži »rezanje gena« (ang: gene slicing) tako, da blokira vezavo transkripcijskih faktorjev, z vezavo specifičnih proteinov (metil CpG vezavnih proteinov) ali pa z encimi, ki jim pravimo histonske deaktilaze (histone deactylases), ki olajšajo nastanek heterokromatina in tako prepreči iniciacijo transkripcije. Tako ima tudi metilacija CpG otočkov telomeraze vpliv na ekspresijo katalitične domene hTERT.

• Histonske acetiltransferaze (HAT) prenašajo acetilne skupine na lizinske ostanke histonov. Ker je lizin pozitivna aminokislina, ki lahko poveča interakcijo z DNA, ki je negativno nabita, vezava acetilne skupine zmanjša transkripcijo gena. Ta proces lahko obrnemo z histonskimi deacetilazami (histone deacetylase; HDAC) – transkripcija bo bolj pogosta. Vir acetilne skupine reakcij kataliziranih s HAT je acetil-koencim A, HDAC pa prenašajo acetilno skupino na sam koencim A.

• Metilacija histonov je modifikacija nekaterih aminokislin, na katere so dodajo ena, dve ali tri metilne skupine. Dodajanje metilnih skupin povzroči, da je afiniteta vezave transkripcijskih faktorjev manjša, saj je dostop do DNA omejen. Ponavadi se s tem transkripcija gena zmanjša. Vendar je znano, da metilacija nekaterih lizinskih in argininskih ostankov histona aktivira transkripcijo. Takšen primer je metilacija lizina 4 na histonu 3 (H3K4) in argininskih ostankov na histonu H3 in H4. Encimi prisotni v teh reakcijah so histonske metiltransferaze (histone methyltransferases; HMT): histon-lizin N-metiltransferaza katalizira metilacijo lizina, histon-arginin N-metiltransferaza pa, analogno s prejšnjim encimom, katalizira metilacijo arginina. Vir metilnih skupin je kofaktor S-adenozilmetionin.

Od vseh epigenetskih sprememb v procesu staranja genom najbolj prizadeneta hipometilacija in hipermetilacija DNA na CpG otočkih. Medtem, ko je DNA hipometilacija povezana z gensko aktivnostjo, je hipermetilacija CpG otočkov znotraj promotorske regije znak za transkripcijsko represijo. S staranjem povezane epigenetske spremembe lahko privedejo do razvoja različnih bolezni, kot so s starostjo povezana nepravilnost vidne pege, rak, Alzheimerjeva bolezen, Wernerjev sindrom, Hutchinson–Guilfordov sindrom, osteoartritis, Parkinsonova bolezen idr.

Sirtuini

Sirtuini so družina visoko ohranjenih genov, ki imajo vlogo pri regulaciji bioloških procesov, kot so transkripcija, apoptoza, popravilo DNA, metabolizem in posledično s temi procesi povezano staranje. S pomočjo encimskih aktivnosti od NAD+ odvisne deacetilaze in/ali ADP riboziltransferaze povezujejo metabolizem z regulacijo transkripcije. Sirtuini pa so tudi proteini Sir (silent information regulator ), ki spadajo v naddružino histonskih deacetilaz. Za svojo aktivnost potrebujejo kofaktor NAD+. Dokazano je, da sodelujejo pri utišanju telomerov, ribosomalni rekombinaciji DNA in ohranjanju genoma.

Vpliv sirtuinov na življenjsko dobo so raziskovali najprej na S. cerevisiae. Opazovali so vpliv sirtuinov na replikativno dobo in kronološko življenjsko dobo. Ugotovili so, da mutacija Sir4 zviša replikativno življenjsko dobo s tem, da se mutiran ne more povezati s Sir2 in Sir3 v tihi kromatinski kompleks na telomerih. Delecija sir2 takrat upade, zato nastajajo dodatne kopije Sir2, ki podaljšajo replikativno dobo. To je dokaz, da je Sir2 glavni regulator tega procesa. Replikativno dobo regulira tudi kopičenje ekstrakromosomalnih rDNA obročev (ERC-jev) v materinski celici. ERC-ji se tvorijo med rekombinacijo rDNA zaporedij. Dodatna kopija ERC-jev v hčerinski celici povzroči prezgodnje staranje. Sir2 inhibira rDNA rekombinacijo, zato delecija njegovega gena povzroči formacijo večje količine ERC-jev in ter tako skrajšuje replikativno dobo.

Vpliv na kronološko življenjsko dobo Sir2 je drugačen. Delecija sir2 podaljša življenjsko dobo pod kalorijsko revnejšimi rastnimi pogoji. Sirtuini se pri metazojih razlikujejo od tistih pri kvasovkah, saj mutacije sir-2.1 ne povzročijo skrajšanja življenjske dobe, vendar pa dodatne kopije sir-2.1 povzročijo podaljšanje življenja tudi do 50% (raziskava na C.elegans). Potencialni mehanizem regulacije genske ekspresije s pomočjo Sir-2.1 vključuje transkripcijski faktor DAF-16 (D. melanogaster). Prevelika ekspresija dSir2 poveča življenjsko dobo, podobno kot pri kvasovkah pa mutacije dsir2 povzročijo njeno skrajšanje. Medtem ko povečanje števila ortologov Sir2 podaljša življenjsko dobo črvov in mušic, pri metazojih še niso odkrili dokazov za povezavo med ERC-ji in staranjem. Za enkrat še ne vemo, ali sirtuini uravnavajo življenjsko dobo tudi pri sesalcih.

Sirtuini so senzorji za energijsko in kalorijsko stanje v celici, ki se odraža v razmerju NAD+/NADH. Znano je, da se omejitev kalorij (CR) pri nevretenčarjih odraža v podaljšanju življenjske dobe pri skoraj vseh testiranih organizmih. Pri sesalcih CR poveča občutljivost na inzulin in izboljša glukozno toleranco, reducira razvoj raka ter zavira s staranjem povezane funkcionalne okvare z modulacijo ekspresije genov. Ko so pri S. cerevisiae znižali količino glukoze v gojišču, se je podaljšala življenjska doba, ter se je ob deleciji sir2 spet povrnila v prejšnje stanje. Če je bil Sir2 preveč izražen, CR ni imela pozitivnega odziva. Raziskava je bila narejena tudi z mutacijo eat-2 , ki kodira zapis za acetilholinski receptor, ki uravnava mišično kontrakcijo požiralnika pri C.elegans. Ker je bil vnos hrane posledično manjši, se je to odražalo v podaljšanju življenjske dobe. Kljub okvari eat-2 pa se to ni zgodilo, če je bil mutiran tudi dSir2.

Sirtuini pa imajo veliko vlogo tudi pri apoptozi, ki je ravno tako del staranja. Delecija Sirt1 ali velika ekspresija mutiranega Sirt1 se odraža v hiperacetilaciji p53 in poviša stopnjo apoptozo pri miših, torej naj bi Sirt1 negativno reguliral p53.

Bolezni

Nepravilnost vidne pege (AMD) je glavni razlog za neozdravljivo slepoto za ljudi po 50. letu starosti. Odkrili so, da imajo bolniki značilne metilacijske vzorce. Za to bolezen je značilno, da se gorišče odkloni od rumene pege. V rumeni pegi je prisoten protein clusterin, ki ga regulira metilacija promotorja, hipometilacija pa povzroča AMD, kar bi lahko pripomoglo k odkritju ustreznega zdravila.

Epigenetika igra pomembno vlogo pri možnostih razvoja Alzheimerjeve bolezni. Bolezen je napredna demenca, za katero je najzgodnejši klinični dokaz disfunkcija spomina. Patološko je bolezen karakterizirana s pojavom senilnih plakov in nevrofibrilarnih pentelj v možganih. Plaki sestojijo iz amiloidnega β proteina (Aβ), ki je 39-43 aminokislin dolg peptid, ki se izreže iz APP (prekurzor za nastanek amiloidnega proteina) z delovanjem β in γ sekretaz. Če pa APP režejo α sekretaze, potem ne pride no nastanka Aβ, saj režejo znotraj Aβ. Do delovanja β in γ sekretaz pride zaradi mutacij na APP in PS1 genu. PS1 je glavna komponenta kompleksa γ sekretaz, ki sestoji še iz 3 drugih proteinov (nikastrin, Aph-1 in Pen-2), ki morajo biti prisotni za njihovo delovanje.

Alzheimerjeva bolezen je sicer neozdravljiva, vendar obstajajo zdravila, ki ublažijo njene simptome in ta so inhibitorji β in γ sekretaz. Promotorski regiji obeh β in γ sekretaznih genov imata metilacijska mesta, vendar med staranjem do metilacije teh mest ne pride, kar povzroči povišano encimsko aktivnost β in γ sekretaz. Čeprav je za to, da ne pride do razvoja Alzheimerjeve bolezni pomemben predvsem molekularni mehanizem ima precej pomembno vlogo tudi prehrana (folat in vitamin B12). Folat je prehrambeni vir metilne skupine za biološko metilacijo in je potreben za pretvorbo homocisteina v metionin in za nastanek S-adenozilmetionina (SAM). SAM je udeležen v metilacijskih reakcijah, ki povzročijo nastanek S-adenozilhomocisteina (SAH) iz katerega nastane homocistein. Če pride do pomanjkanja folata, pride do kopičenja SAH (ki je inhibitor DNA metiltransferaz) in visokega nivoja homocisteina v krvi. Visok nivo homocisteina v krvi pa je značilen za bolnike z Alzheimerjevo boleznijo.

Progeroidni sindromi so sindromi, ki povzročijo pospešeno staranje. Eden izmed teh je Wernerjev sindrom, do katerega pride zaradi hipermetilacije promotorjev CpG otočkov, kar povzroči, da se gen WRN ne prepisuje oz. pride do nastanka zelo kratkega Wernerjevega proteina, ki se zelo hitro razgradi. Nekatere raziskave so pokazale, da ta zelo kratek protein ne pride do jedra, kjer naj bi normalno interagiral z DNA.

Wernerjev protein ima v celici veliko nalog, ki vključujejo vzdrževanje in popravljanje DNA, pomaga tudi pri DNA replikaciji in pripravi celice na celično delitev. Celice s spremenjenim Wernerjevim proteinom se lahko delijo manj pogosto kot normalne, kar vodi do neuspešne rasti, povzročijo pa tudi kopičenje škode na DNA, kar poslabša normalne celične aktivnosti in povzroči še mnoge druge zdravstvene težave kot so rak, bolezni srca, ateroskleroza, diabetes.

Sindrom, ki prav tako spada med progeroidne sindrome je Hutchinson–Guilfordov sindrom, ki se od Wernerjevega razlikuje po tem, da se simptomi te bolezni pojavijo že zelo zgodaj, medtem ko do pojava simptomov pri Wernerjevem sindromu pride v času pubertete. Hutchinson–Guilfordov sindrom povzročijo mutacije na LMNA genu, ki vsebuje navodila za nastanek lamina A. Ta protein igra pomembno vlogo pri določitvi oblike jedra v celici in je glavna komponenta jedrne ovojnice, ki daje oporo jedrni membrani. Mutacije na LMNA genu povzročijo nastanek nenormalne verzije lamina A. Spremenjen protein povzroči nestabilnost v jedrni ovojnici in škoduje jedru, kar povzroči da celica prezgodaj odmre. Kako točno te spremembe pripeljejo do tega sindroma, pa raziskovalci še poskušajo ugotoviti. Zaenkrat trdijo, da naj bi pri vsakem od primerov te bolezni prišlo do nove mutacije in sicer v spermiju ali jajčecu tik pred spočetjem.

Zadnja izmed opisanih bolezni, ki je prav tako povezana s staranjem pa je Parkinsonova bolezen, je bolezen ki se kaže v upočasnjeni gibljivosti, mišični rigidnosti in značilnem ritmičnem tremorju. Pri močno napredovani bolezni lahko pride do popolne nezmožnosti gibanja. Kot sekundarni simptomi pa se pojavijo tudi motnje v čustvovanju in zaznavanju. Do te bolezni pride zaradi pomanjkanja dopamina v možganih. Do pomanjkanja dopamina v možganih pride zaradi O-metilacije dopamina z katehol-O-metiltransferazo (COMT), kar vodi do inaktivacije in degradacije tega zelo pomembnega nevrotransmiterja.

Vse te spremembe, ki se odražajo tako pri krajšanju telomer, kot tudi pri modifikacijah, ki privedejo do bolezni, imajo nek mehanizem, ki še ni popolnoma znan. Zato je cilj razviti DNA genomsko porazdelitev metiliranih sekvenc (ang: DNA methylome) in karto histonskih modifikacij, saj bi jim to pomagalo opredeliti lastnosti »stare« in »mlade« celice. Za dosego teh ciljev pa moramo najprej bolje razumeti procese staranja na molekularni ravni.

---

Viri

• Loayza D, De Lange T. (2003) POT1 as a terminal transducer of TRF1 telomere length control. Nature. 2003 Jun 26;423(6943):1013-8.
• Calvanese V, Lara E, Kahn A, Fraga MF. (2009) The role of epigenetics in aging and age-related diseases. Ageing Res Rev. 2009 Oct;8(4):268-76. Epub 2009 Apr 1.
• Ducrest AL, Szutorisz H, Lingner J, Nabholz M. (2002) Regulation of the human telomerase reverse transcriptase gene. Oncogene. 2002 Jan 21;21(4):541-52.
• Genetics Home Reference. Hutchinson-Gilford progeria syndrome. (citirano 8.4.2011)http://ghr.nlm.nih.gov/condition/hutchinson-gilford-progeria-syndrome
• U.S. National Library of Medicine. Werner Syndrome. (citirano 9.4.2011). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22252/
• Medic8. Werner Syndrome. (citirano 9.4.2011) http://www.medic8.com/genetics/werner-syndrome.htm
• North BJ, Verdin E (2004). Sirtuins: Sir2-related NAD-dependent protein deacetylases
• Tollefsbol, Trygve O., (2010) Epigenetics of Aging, str 11-371