Odkritje kratke lasnične RNA (shRNA)

Zgodovina pred poskusi z uporabo shRNA

Lin-4 in let-7 sta molekuli miRNA v C elegans. Lin-4 so odkrili že davnega 1993. Ugotovili so, da je dolg okoli 20 nukleotidov in da nastane iz prekurzorske molekule, ki vsebuje lasnično zanko. Z različnimi poskusi so dokazali, da je lin-4 ključen za postembrionalni razvoj in da negativno regulira gene za določene proteine (gen lin-14 in lin-28). Mehanizem takrat še ni bil znan. Nekaj let kasneje so odkrili let-7 RNA, ki je približno iste velikosti kot lin-4 in prekurzor prav tako vsebuje lasnično zanko. Let-7 prav tako negativno regulira nekatere gene (lin-14...). Podobno kot lin-4, tudi let-7 sodeluje pri postembrionalnem razvoju (Lee et al. 1993, Pasquinelli et al. 2000, Relahart et al. 2000). Mehanizem je takrat prav tako bil neznan.

Čez par let so odkrili RNAi, njen mehanizem preko delovanja proteinov Dicer in RISC, tarčnega ciljanja mRNA in pojasnili, da sta lin-4 in let-7 miRNA. Kmalu zatem so znanstveniki želeli z uporabo umetne RNA inducirati inhibicijo določenih genov. Sprva so to poskušali z dsRNA. Prvi eksperimenti so potekali na C. Elegans. (Grishok et al. 2001, Hutvanger et al. 2001, Ketting et al. 2001). Pri poskusu so v gliste injecirali dsRNA in opazovali odgovor. Opazili so, da se dsRNA spremeni v siRNA dolg približno 22nt. Si RNA nato sproži uničenje mRNA. Ključni pri omenjenem poskusu sta bila lin-4 in let-7. Znanstveniki so sklepali, da je prekurzor lin-4 in let-7 analogen dsRNA in miRNA istih prekurzorejv analogen siRNA. Za to obstaja več dokazov. Na kratko, za oba precesa so potrebni isti proteini (DCER-1, alg 1 in 2, red-1). Kmalu so podoben poskus izvedli na sesalcih, a je bil zaradi antivirusnega poskusa negativen. Pri sesalcih se zaradi dsRNA, posledično interferona, aktivira protein kinaza PKR. PKR nato sproži protivirusni odgovor in vodi celico v apoptozo (Gil in Esteban 2000). Tudi če v somatskih celicah zavremo PKR odziv, dsRNA sproži nespecifični odziv genske represije (Abraham et al., 1999; Paddison et al. 2001). Znanstveniki so zato skušali najti drugo pot, ki bi temeljila na istem principu. Ena izmed teh je bila konstrukcija shRNA z značilno lasnično zanko. Ta naj bi mimificirala prekurzorje miRNA, ki tudi vsebujejo lasnično zanko. Sh RNA tako v celici sproži RNAi odgovor. Do prvih uporab shRNA pri znanstvenih poskusih je prišlo leta 2002. Paddison et al., Brummelkamp et al., Paul et al., Sui et al.,Yu et al., Zeng et al., so ločeno injicirali spremenjeno dsRNA, ki je spominjala na endogeno shRNA in ni sprožila antivirusnega odgovora.

Raziskave, ki so privedle do ustvarjanja trajnih celičnih linij sesalcev s pomočjo shRNA

Raziskovalci so želeli testirati možnost, da bi s posnemanjem lasnične RNA uspeli zmanipulirati gene tako, da bi določeni ostali utišani pri podvojevanju celic in pri dedovanju.

shRNA sproži utišanje genov v celicah Drosophila

Učinkovitost različnih kratkih lasničnih RNA, tako tistih s popolnim in nepopolnim ujemanjem s ciljnim substratom, so testirali na celicah Drosophila v S2 fazi. Za najbolj učinkovite so se izkazale tiste z enostavno lasnično strukturo ter s popolno homologijo do substrata. Na učinkovitost ni vplivala velikost zanke ali sekvenca na zanki. Rezultati so pokazali, da Dicer prepozna in predela shRNA, ki posnema njegov naravni substrat(let-7) in tudi tiste s preprosto lasnično strukturo. Zaključili so, da je lahko rekombinantna shRNA preko Dicer-ja procesirana v siRNA in s tem potrdili prvotno idejo, da kratka lasnična zanka sproži utišanje genov preko mehanizma RNAi.

Utišanje genov v sesalskih celicah

Celice sesalcev vsebujejo endogene sisteme kot na primer PKR-preko dsRNA aktivirana protein kinaza, ki ovirajo delovanje RNAi. Da se kinaza aktivira, je potreben dupleks daljši od 30 baznih parov. Kratka RNA, ki posnema produkte Dicer-ja lahko obide sistem varovanja in utiša izražanje genov. Učinkovitost shRNA pri utišanju so spremljali pri embrionalnih celicah človeških ledvic in jih primerjali z učinkovitostjo utišanja s siRNA. Rezultati so pokazali, da je bila v povprečju učinkovitost siRNA večja(90-95%) kot pri shRNA(80-90%). Pokazalo se je tudi, da so enostavnejše lasnične RNA pri utišanju uspešnejše od tistih, ki posnemajo naravni substrat encima Dicer. Primerjali so tudi uspešnost različno dolgih shRNA. Največja učinkovitost se je pokazala pri shRNA dolgih od 25-29bp, znatno zmanjšanje pa se je pokazalo pri dupleksih krajših od 22bp. Delovanje shRNA so potrdili še na rakavih celicah človeka, epitelnih celicah opic in fibroblastih glodalcev.

Sinteza shRNA

Sinteza shRNA in vitro – uporaba T7 RNA polimeraze

Transkripcijske templete za sintezo shRNA in siRNA so pripravili s pomočjo DNA sinteze. Tako sintetizirane shRNA in siRNA so preizkušali tako na celicah Drosophila in embrionalnih celicah človeških ledvic. Obe RNA sta pokazali enako učinkovitost kot njuni kemijsko sintetizirani različici. Problem se je pojavil pri sprožitvi sinteze, saj T7 polimeraza za začetek potrebuje dva gvanozinska ostanka, ki ju je potrebno dodati, da se sinteza lahko začne, ta pa lahko vplivata na delovanje siRNA. Zato je bolj uporabna sinteza shRNA, ki jo potem Dicer preoblikuje v aktivno obliko siRNA.

Sinteza shRNA in vivo – uporaba RNA polimeraze III

Preizkusili so želeli možnost sinteze na bolj naraven način z uporabo RNA polimeraze III. Promotorji RNA imajo dobro definirana začetna in končna mesta sinteze ter naravno sintetizirajo različne majhne in stabilne RNA. Dobro preučena promotorja U6 snRNA in H1 RNA sta omogočila manipuliranje promotorja do sinteze shRNA. Sinteze so se lotili tako, da so v zaporedje tik za U6 snRNA promotorjem vstavili mesto kloniranja in s tem pridobili vektor, ki izkorišča lasnično zanko za utišanje genov. V vektor so klonirali shRNA zaporedje (pridobljeno iz luciferaze). S transfekcijo so vektor skupaj s plazmidom za izražanje luciferaze kresničke in Renilla vstavili v embrionalne celice človeških ledvic. Utišanje genov je bilo v obeh primerih shRNA učinkovito. Preizkus zmožnosti vektorsko kodirane shRNA , da trajno utiša izražanje gena, so ustvarili lasnico, ki je ciljala na miškin p53 gen. Transfekcija z ras je v kontrolni kulturi celic povzročila prenehanje rasti, medtem ko so se v celični kulturi z vstavljenim shRNA vektorjem celice razmnoževale naprej še nekaj tednov. Analiza kultur pokaže, da je shRNA vektor utišal izražanje gena za p53 tako v prvotnih celicah kot tudi v njihovih potomkah.

Rezultati nakazujejo na to, da se lahko s pomočjo shRNA ustvari trajne celične linije sesalcev pri katerih je želeni gen trajno utišan.

Bi-funkcionalna shRNA

Gre za najnovejšo tehnologijo, ki so jo opisali šele leta 2009 in je še vedno v razvoju. Bi-funkcionalna shRNA je sintetična majhna RNA, s pomočjo katere bi lahko manipulirali in vplivali na delovanje shRNA v celici. Razvili so jo, da bi z njeno pomočjo pospeši in povečali učinkovitost utišanja genov. Njena glavna prednost je ta, da je sestavljena iz dveh shRNA molekul, ki se lahko posamič vežeta ena na t.i. cepitveno-odvisen in druga na cepitveno-neodvisen RISC. Celotna bi-funkcionalna shRNA sestoji iz dveh stebličastih shRNA, ki se zaključita z lasnično zanko. V celico vstavijo ustrezen plazmidni vektor iz katerega se nato prepiše. Ena shRNA ima v celoti ujemajoči se verigi, deluje kot navadna shRNA in se na enak način pripne na cepitveno-odvisen del RISC-a. Druga ima na sredini dva neujemajoča se dela, locirana na 9.-12. bazni par, ki omogočata vezavo na cepitveno-neodvisen RICS. Ko se končna produkta obeh shRNA vežeta na mRNA, tako hkrati inducirata transkripcijo in poskrbita za degradacijo mRNA. S takšnim, dopolnjujočim se delovanjem, poteka utišanje genov hitreje in bistveno učinkovitejše.

Bi-funkcionalna shRNA

Primerjava siRNA in miRNA s shRNA

siRNA je krajša in ima to posebnost, da se lahko nalaga na RICS brez, da bi šla preko vmesnega Dicer encimskega kompleksa. Komplementarno mRNA lahko cepi tako v citoplazmi kot v jedru. Ker so se pojavljali problemi ob uporabi siRNA pri poskusih in vivo, so razvili novo, shRNA, ki je večja in lahko zato utiša večje dele genov. Nastane lahko s pomočjo transkripcije iz dsDNA z lasničnim zavojem, ki jo v celico dodamo preko ekspresorskega vektorja. Ko se shRNA enkrat veže na RISC, se utišanje genov nadaljuje po enakem mehanizmu kot pri siRNA. ShRNA v celici lahko nastane s transkripcijo iz ekspresorskega vektorja, ki ga v celico moramo dodati, medtem ko lahko siRNA nastane samo iz prekurzorja, ki je lahko bodisi shRNA ali pa dsRNA. Na splošno naj bi bilo delovanje shRNA učinkovitejše, ker jo celica sama sintetizira v jedru, medtem ko so za siRNA ugotovili, da se je v dveh dneh po vbrizgavanju, manj kot 1 % vseh siRNA vključil v mehanizem celice. Vendar pa vsem tem trditvam ne moremo povsem zaupati, saj so pri različnih raziskavah dobili precej različne rezultate. Prednost siRNA je v tem, da že majhna koncentracija teh molekul lahko zavre zapis nekega gena, medtem ko pri shRNA za isti efekt potrebujemo več molekul. Sklepamo lahko, da imata obe svoje prednosti in slabost. Za razliko od teh dveh majhnih RNA, je miRNA endogena in sodeluje še pri številnih drugih celičnih procesih. Njena posebnost je tudi ta, da v nasprotju z drugima dvema ni potrebno popolno ujemanje z mRNA. Utiša lahko že gen, s katerim imata le delno komplementarno verigo, zato lahko vpliva na bistveno večje število genov. Lahko pa celo vpliva na samo DNA in tako regulira izražanje genov že pred nastankom mRNA.

Viri

1. Grishok et al.: Genes and Mechanisms Related to RNA InterferenceRegulate Expression of the Small Temporal RNAs that Control C. elegans Developmental Timing, Cell 2001, št. 106, str. 23-24

2. Rosalind C. Lee et al.: An Extensive Class of Small RNAs in Caenorhabditis elegans. Science 2001, št. 294

3. Hutvagner et al.: A Cellular Function for the RNA-Interference Enzyme Dicer in the Maturation of the let-7 Small Temporal RNA. Science 2001, št. 293

4. Paddison et al.: RNA interference: the new somatic cell genetics?. Cancer cell, 2002,št. 2

5. Paddison P.J. et al.: Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes and Development, 2002, letn. 16, str. 948-58.

6. Donald D. Ron et al.: siRNA vs. shRNA: similarities and differences, Advanced Drug Delivery Reviews, 2009, št. 61, str. 746-759

7. Wang Z. et al.: RNA Interference and Cancer Therapy, Expert reviews, 2011, št. 28, str. 2983-2995