Možni pristopi k zdravljenju raka z RNAi

Uvod

Z imenom rak označujemo skupino bolezni, katerih skupna značilnost je nenadzorovana proliferacija in sposobnost napadanja drugih tkiv. Danes najpogostejše oblike zdravljenja so operativni posegi, zdravljenje z zdravili, ki pobijajo rakaste celice ali zavirajo njihovo rast, radioterapija in imunoterapija. Naštete metode so precej nespecifične in invazivne zato poleg rakavih celic močno prizadanejo tudi zdravo tkivo, kar se odraža v hudih stranskih učinkih. Delovanje RNAi pa je usmerjeno na en ali na skupek sorodnih genov, zato je učinek lokaliziran le na mutirane celice.

Vpliv RNAi v tumorskih celicah

Princip delovanja RNAi je pri tumorskih celicah popolnoma enak kot pri normalnih celicah. Ugotovljeno pa je bilo, da je izražanje miRNA pri rakavih celicah drugačno kot pri normalnih celicah, pri čemer se poveča predvsem ekspresija onkogenske miRNA. Na podlagi izražene miRNA je možno ugotoviti tako vrsto raka kot tudi stadij njegovega razvoja. Z induciranim spreminjanjem ekspresije miRNA pa je možno doseči tudi spremembe v fenotipu raka. Prav ti dve značilnosti sta osnova za razvoj zdravljenja z RNAi.

Potencialne tarče zdravljenja

S pomočjo študij mutacij, ki se pojavljajo v malignih tumorjih, so ugotovili, da so v rakavih celicah najpogostejše spremembe genov, ki zapisujejo za:

• proteine,ki sodelujejo pri regulaciji celičnega cikla,kot sta p53 in pRb,
• tirozin kinaze,
• pro- in antiapoptotske proteine,
• proteine povezane s celičnim staranjem,
• proteine, ki celicam omogočijo pritrditev na podlago in medsebojno povezovanje,
• proteine, ki vplivajo na razgradnjo in stabilnost drugih proteinov.

Poleg zgoraj naštetih so kot tarče za zdravljenje z RNAi uporabni tudi nekateri transkripcijski faktorji (npr. VEGF), ki sodelujejo pri ožiljenju, rasti ali razširjanju tumorjev po telesu. S pomočjo vnosa sintetične miRNA ali siRNA je možno raziskovanje celičnih procesov, ki so specifični ali okvarjeni v rakavih celicah. Kot primer naj navedem, da so s pomočjo RNAi vektorjev in sistematičnega raziskovanja ter primerjave med izražanjem genov v rakavih in normalnih celicah, identificirali deubikvitinacijske encime in gene, vpletene v proces s TRAIL inducirane apoptoze. Poleg tega lahko s selektivnim sistematičnim utiševanjem posameznih genov raziskujemo vlogo in vpliv posamičnih proteinov na procese, kot so apoptoza in proliferacija, ki so spremenjeni pri praktično vseh vrstah rakov. S takšnim načinom raziskovanja so določili tudi zgoraj naštete tarče zdravljenja z RNAi.

Razvoj terapevtikov

Manipulacija izražanja genov lahko poteka z miRNA, s katero hkrati vplivamo na več genov, ki pa so pogosto medsebojno povezani v smislu skupnega vpliva na določen celični proces, ali s siRNA, ki je specifična za en sam gen.

Ena veja razvoja RNAi terapevtikov želi ustvariti zdravila, ki temeljijo na utišanju antiapoptotskih genov in genov udeleženih pri proliferaciji, s čimer bi rast tumorjev vsaj ustavili, oziroma rakave celice uničili. Druga veja pa razvija terapevtike, ki bi s svojim delovanjem preprečili izražanje proteinov, ki povzročajo rezistenco tumorskih celic na kemoterapevtike. S tem bi dobili dobra podporna zdravila, ki bi izboljšala uspešnost kemoterapije. Pri rakih, za katere je značilna okvara dicerja, pa zaradi drugačnega načina izražanja miRNA, terapije z RNAi niso uspešne.

Princip delovanja terapevtikov

Kot smo že omenili, so razlike fenotipov normalnega in rakavega tkiva osnova za razvoj terapevtikov. Do danes so razvili dva principa delovanja zdravil: neposredno in posredno. Pri neposredni metodi uporabljajo za blokiranje ekspresije onkogene miRNA in nadomeščanje tumor supresorske miRNA, ki je v rakavih celicah manj izražena, oligonukleotide in virusne konstrukte. Pri posredni metodi uporabljajo zdravila, ki ne delujejo direktno na miRNA, ampak preko kompleksov, ki sodelujejo pri zorenju v zrelo miRNA.

• Protismerni oligonukleotidi delujejo kot kompetitivni inhibitorji na onkogeno miRNA. So komplementarni zaporedju željene miRNA in se ob vstopu v celico nanjo vežejo. Skupaj tvorita dupleks, ki se kasneje razgradi. V prvem poskusu so inhibitorno miRNA vbrizgali v D. melanogaster in koncentracija onkogene miRNA se je znižala. Ker enak poskus pri C. elegans ni bil uspešen, so znanstveniki s kemijsko modifikacijo stabilizirali inhibitorno miRNA ter tako povečali njeno specifičnost. miRNA je stabilizirana z metilno ali metoksietilno skupino na 2’-O mestu na ribozi. Delovanje protismernih oligonukleotidov so Krutzfeldt et al. pokazali na primeru miR-122, ki je najbolje izražena v jetrih. V mišjo repno veno so vbrizgali inhibitorno miRNA, drugače imenovano antagomir, in po 24 urah so opazili spremembo v koncentraciji miR-122. S tem so pokazali, da je utišanje genov s to metodo specifično, učinkovito in dolgotrajno, kajti učinek utišanja je trajal 23 dni.

• miRNA pivniki so transkripti z vezavnimi mesti za miRNA, katere delovanje želimo v celici preprečiti. V celici tekmujejo za vezavo onkogene miRNA z mRNA. V celici se prepisujejo iz predhodno vstavljenega vektorja. miRNA ima večjo afiniteto do tega transkripta kot do tarčne mRNA. Prvi razlog za to je popolna komplementarnost zaporedja onkogene miRNA in transkripta, drugi pa umetno narejena izboklina na mestu vezave za ago2 protein, ki omogoči bolj stabilno vezavo med miRNA pivniki in onkogeno miRNA v kompleksu RISC. Eksperiment je pokazal, da miRNA pivniki v organizmu učinkujejo podobno kot protismerni oligonukleotidi.

• Obnova ekspresije tumor supresorske miRNA: Dejstvo, da je v rakavem tkivu nižji nivo tumor supresorske miRNA v primerjavi z normalnim tkivom, izkoristimo tako, da jo dodamo umetno: intravenozno ali preko adenovirusnih vektorjev. Intravenozno vnašamo miRNA posnemovalke. To so dvovijačne, majhne in kemijsko modificirane molekule, ki inducirajo programirano celično smrt in blokirajo proliferacijo. V številnih tipih rakov je inhibirano izražanje miR-15a in družine miR-29. Eksperiment je pokazal, da ob vnosu teh dveh miRNA posnemovalk v jetrne tumorje ali rabdomiosarkome pride do inducirane celične smrti in posledičnega zmanjšanja tumorskega tkiva. Pri drugi metodi pa z adenovirusi transduciramo vektor v celico, s čimer zagotovimo dolgoročno ekspresijo in minimalno toksičnost. Dokazano je bilo, da je ekspresija miR-26 v jetrnih tumorjih zmanjšana. Kota et al. pa so pokazali, da z vnosom adenovirusnega vektorja miR-26 dosežejo zmanjšanje tumorjev in zmanjšano stopnjo proliferacije.

Shema principov delovanja terapevtikov

miRNA kot pomoč pri diagnosticiranju raka

Razlike v ekspresiji miRNA v rakavih celicah glede na normalne celice lahko uporabimo tudi za diagnosticiranje vrste raka. Lu et al. so v raziskavi pokazali, da je potrebno le približno 200 genov miRNA za uspešno klasifikacijo človeških rakavih obolenj. Za primerjavo naj navedem podatek, da so podobno klasifikacijo poskušali izvesti na podlagi mRNA. Uporabili so 16.000 genov mRNA, ki kodirajo za proteine, vendar jim ni uspelo najti povrzave med rakom z istim izvorom. Nasprotno pa imajo raki iz iste družine (npr. tumorji endotelijskega izvora: rak na debelem črevesu, rak na jetrih, trebušni slinavki) podoben profil izražanja miRNA. Baza podatkov z značilnimi miRNA profili za različne tumorje bi lahko v prihodnosti olajšala diagnozo in tudi zdravljenje raka, saj je s profilom izražanja miRNA poleg vrste raka možno določiti tudi stopnjo diferenciacije tumorskih celic. Ti dve informaciji pa bi bili v veliko pomoč pri odločitvah o vrsti terapije za pacienta. Ugotovljeno je bilo tudi, da so pri določenih vrstah raka tudi v krvni plazmi prisotne različne miRNA. miRNA bi tako lahko uporabili kot neinvazivni biomarker za zgodnje odkrivanje raka, vendar so potrebne nadaljne raziskave, s katerimi bi določili normalne nivoje miRNA v krvi.

Ovire pri zdravljenju raka z RNAi

• Ena od največjih težav, s katerimi se srečujejo raziskovalci pri razvoju RNAi terapevtikov je vnos siRNA/shRNA v celico. Molekule RNAi lahko vežejo na prenašalce, od katerih so trenutno najbolj perspektivni različni nanodelci.
• Težavo lahko predstavlja tudi nespecifičnost RNAi. Čeprav je siRNA specifična za določen gen, lahko pride do hibridizacije s transkripti, ki vsebujejo le delno skladno zaporedje. Včasih je dovolj že 6-8 nukleotidov. Metilacija hidroksilne skupine na ribozi poveča afiniteto siRNA do določenega zaporedja.
• Rakave celice imajo pogosto zmanjšano koncentracijo dicerja in droshe, kar vpliva na procesiranje prekurzorjev siRNA. Pride lahko tudi do prenasičenja kompleksov RISC, kar vodi v tekmovanje med eksogeno siRNA/miRNA in endogeno miRNA. Posledično se lahko izrazijo geni, ki jih regulira endogena miRNA.
• Treba je tudi upoštevati, da se normalne celice na vstavljeno RNAi odzovejo drugače kot rakave celice. Ponavadi utišanje traja dlje v normalnem tkivu, saj se rakave celice delijo hitreje in pride do razredčenja interferenčnih molekul.
• Rezistenca na RNAi: Pri siRNA lahko zaradi zelo specifične vezave že pri točkovnih mutacijah v tarčnem zaporedju pride do rezistence tumorskih celic na RNAi. Nekatera zaporedja so lahko tudi nedostopna za siRNA zaradi sekundarnih struktur ali vezanih proteinov. Tem dvem težavam se lahko izognemo tako, da si izberemo več zaporedij na tarčni mRNA in več tarčnih mRNA v sami celici. Z utišanjem genov pa ne moremo vplivati na že obstoječe proteine, zato je tudi dolga življenjska doba proteinov oblika rezistence. Rakave celice lahko postanejo odporne na RNAi tudi z mutacijo ali zmanjšanim izražanjem genov za proteine, ki sodelujejo pri procesiranju siRNA/miRNA (dicer, drosha, RISC kompleks). Te mehanizme rezistence bo potrebno še natančneje raziskati, da se bo lahko RNAi uporabljala za zdravljenje raka.

Perspektive

Večina farmacevtskih podjetij se ukvarja z razvojem zdravil na osnovi siRNA. Vsako zdravilo mora biti potrjeno v petih fazah kliničnega testiranja. Glede na to, da so vsi RNAi terapevtiki zaenkrat v fazi I ali II, v bližnji prihodnosti še ne moremo pričakovati zdravila za rakava obolenja, ki bi delovalo na osnovi RNA interference. Zaenkrat raziskave temeljijo na manipulaciji ene miRNA ali ene družine miRNA. Znanstveniki predvidevajo, da je razvoj raka odvisen od medsebojnega vpliva različnih miRNA, zato bo za učinkovito zdravljenje najverjetneje potrebno razviti zdravila, ki bodo vplivala na celotno mrežo miRNA v obolelih celicah in ne na eno samo. Izboljšave terapevtikov stremijo k minimalni toksičnosti nosilcev in maksimalni specifičnosti zdravila. Vizija razvoja je izdelava terapevtikov za vse vrste rakov, na katere lahko vplivamo z RNAi.

Viri

• Garzon R., Marcucci G., Croce C. M. Targeting microRNA in cancer: rationale, strategies and challenges. Nature reviews drug discovery, 2010, vol. 9, str. 775-789.
• Pai SI et al. Prospects of RNAi interference therapy for cancer. Gene therapy, 2006, vol. 13, str. 464-477.
• Petrocca F. in Lieberman J. Promise and challenge of RNA interference - based therapy for cancer. Journal of clinical oncology, 2011, letn. 29, štev. 9, str. 747-754.
• Pecot C. V. et al. RNA interference in the clinic: challenges and future directions. Nature reviews, 2011, vol. 11, str. 59-67.
• Esquela-Kerscher, A. in Slack, F. J. Oncomirs — microRNAs with a role in cancer. Nature Reviews Cancer, 2006, štev. 6, str. 259-269