Mitozna rekombinacija

Uvod

Dvojni prelomi DNA, ki so posledica visokoenergijskega sevanja ali produktov celičnega metabolizma, za celico predstavljajo poseben izziv, saj informacije o pravem nukleotidnem zaporedju ni v neposredni bližini prelomov.

Eden in natančnejši od dveh poznanih mehanizmov popravljanja dvojnih prelomov je homologna rekombinacija (HR), pri kateri jedrni encimi poiščejo informacijo o dvojnem zaporedju na homolognem zaporedju sestrske kromatide (HR poteka v pozni S- ali v G2-fazi celičnega cikla), ki je prostorsko bližje od homolognega kromosoma.

Homologna rekombinacija poteče v treh korakih: prvi je procesiranje prelomljenih dvoverižnih koncev (double-strand break end processing), drugi je formacija filamenta iz jedrnega proteina Rad51 in vrinjenje v homologno mesto v dvojni vijačnici (Rad51 nucleoprotein filament formation and strand invasion), tretji pa je bodisi od sinteze odvisno prileganje verig (synthesis-dependent strand annealing) bodisi popravilo dvojnih prelomov (double-strand break repair).

Razgradnja koncev 5' -> 3'

Pri evkariontih so prelomljeni konci podvrženi razgradnji 5' -> 3', pri čemer se izpostavijo 3'-OH-repki na komplementarni verigi. To poteče ob katalizi kompleksa MRN, ki se hitro veže na dvojni prelom, za njim pa se veže še CtIP, kar omogoči endonukleazno cepitev 5'-konca ene od verig.

MRN je kompleks proteinov Mre11, Rad50 in Nbs1. Prvi v HR deluje kot ssDNA-endonukleaza, ki omogoči fosforilacijo CtIP s Cdk2, kar poveča stabilizacijo kompleksa MRN, ter dimerizacijo Rad50, homodimer Rad50 pa ima DNA-vezavno domeno in ob hidrolizi ATP povzroči konformacijske spremembe v kompleksu, ki se odražajo v sprožitvi endonukleazne aktivnosti. Nbs1 je vključen v signalizacijo ob poškodbah DNA preko ATR, ki povzroči zaustavitev celičnega cikla v kontrolni točki G2/M.

Nadaljnjo razgradnjo 5' -> 3' katalizira EXO1-nukleaza ali DNA2-nukleaza v kompleksu s helikazo BLM.

BLM se rekrutira na DNA preko kompleksa MRN. BLM fizično interagira z DNA2, njuno polarizirano nukleazno aktivnost (ta je sklopljena s hidrolizo ATP) pa omogoči vezava RPA.

BLM olajša tudi vezavo EXO1, vendar kot helikaza ne sodeluje pri tej poti razgradnje DNA v smeri 5' -> 3'. EXO1 se lahko na mesto delovanja veže brez MRN, a slednji poveča procesivnost te nukleaze in učinkovitost njene aktivnosti.

Ovijanje 3'-OH-repkov s proteini RPA

3'-OH-repke ovije RPA (replikacijski protein A, evkariontski protein, ki se veže na ssDNA). Njegova vloga je preprečitev razkroja repka in tvorbe sekundarnih struktur, ob tem pa kompleks vezanega RPA na ssDNA sproži številne fosforilacije, ki ustavijo nadaljevanje celičnega cikla, dokler ne pride do popravila dvojnega preloma. RPA ob posredovanju BRCA2 nadomesti filament iz monomernih enot Rad51.

Zamenjava proteinov RPA z Rad51

Protein BRCA2 tvori kompleks še z dvema proteinoma, PALB2 in BRCA1. Tako sestavljen kompleks sodeluje kot mediator pri zamenjavi proteinov RPA z Rad51, in je eden izmed najpomembnejših kompleksov, ki sodelujejo pri popravljanju dvojnih prelomov DNA. Za pravilno delovanje kompleksa so ključni vsi trije proteini; splošno znano je tudi dejstvo, da so mutacije genov BRCA povezane s pojavom raka na dojki in rakom jajčnikov. Protein BRCA2 torej v kompleksu pomaga najprej pri zamenjavi RPA z Rad51, nato pa tudi stabilizira Rad51-ssDNA nukleofilament.

Iskanje homologne regije

Ko so proteini Rad51 nameščeni in stabilizirani na ssDNA, ta novonastali filament začne z iskanjem homologne regije na sestrski kromatidi oz. homolognem kromosomu. Natančen mehanizem iskanja homologije je zaenkrat še neznan, predpostavljenih pa je bilo več modelov. Prvi model predpostavlja naključno preizkušanje (angl. probing) v 3 dimenzijah v bližini mesta dvojnega preloma. Dokazano je namreč bilo, da se procent uspešnosti lociranja homologne regije zmanjšuje z njeno oddaljenostjo od mesta dvojnega preloma. Prav tako je uspešno lociranje hitrejše v primeru daljšega ssDNA nukleofilamenta. Obe dejstvi nakazujeta na naključnost iskanja prileganja. Predlagani so bili tudi modeli, ki predpostavljajo izmenjevanje med 3D naključnim iskanjem in 1D premikanjem po DNA molekuli. Tu naj bi ssDNA naključno v 3D iskala sestrsko kromatido, ko pa nanjo naleti, se začne ob njej linearno (1D) premikati do homolognega mesta. Premikanje vzdolž verige naj bi vodil visokoprocesivni motorni protein Rad54.

Od sinteze odvisno prileganje koncev (SDSA)

Synthesis dependant strand annealing (SDSA) oz. od sinteze odvisno prileganje verig je prvi od dveh možnih mehanizmov popravljanja dvojnega preloma s homologno rekombinacijo. Model je bil prvič predlagan leta 1976, saj se nekateri rezultati niso skladali z napovedmi Hollidayevega modela za homologno rekombinacijo. Ko filament ssDNA-Rad51 z zgoraj opisanim procesom najde homologno regijo na sestrski kromatidi, Rad51 promovira vdor oz. vrivanje vanjo (angl. strand invasion). Ustvari se tako imenovana izpodrinjena zanka (angl. displacement loop, D-loop) oz. D-zanka. Zanko tvorita izpodrinjena veriga in hetero-dupleks matrične in podaljševane verige. Vrivajoči oz. vdirajoči 3'-OH konec verige je podaljšan s pomočjo DNA polimeraze v procesu DNA sinteze. Pri tem se D-zanka premika skupaj z novonastajajočo verigo; nastane tako imenovani potujoči replikacijski mehurček. Pri tem pride do konservativne replikacije verige, saj je nova veriga sproti izpodrinjena z matrične, ki se nato za potujočim mehurčkom zapira nazaj s svojo originalno komplementarno verigo. Med tem procesom nikoli ne pride do tvorbe daljše hetero-dvojne vijačnice; potujoči replikacijski mehurček zato med procesom ostane majhen in ne raste. Ko je sintetizirana zadostna dolžina verige, se ta odmakne iz D-zanke in njen konec nato poišče sebi komplementarni konec na verigi z druge strani dvojnega preloma. Ko je ustrezno mesto prileganja najdeno, se z njim poveže, preostale vrzeli pa so zapolnjene s pomočjo DNA-polimeraze in zareze povezane z DNA-ligazo. Produkti so vedno nepremeščeni oz. neprekrižani (angl. non-crossover).

Popravilo dvojnih prelomov DNA (DSBR)

Sinteza manjkajočih fragmentov DNA

Po formaciji D-zanke ostane tudi v tem primeru izpostavlji 3´-OH skupina na samostojnih verigah, kjer lahko poteka nova sinteza DNA z DNA polimerazo. Najprej se sintetizira ena veriga, ko najde pravo nukleotidno zaporedje, nato se sintetizira še druga na podlagi druge verige homolognega kromosomma (sestrska kromatida). D-zanka se povečuje dokler se ne sintetizira dovolj dolg segment. DNA ligaza nato zlepi novo sintetizirana dela s 5´-koncem preostale verige, tako da na novo ustvari fosfodiestrsko vez . Oba konca spojena skupaj imenujemo Hollidejeva zanka (Holliday junctions), dobimo torej dve Hollidajevi zanki.

Hollidayeva zanka

Strujtura je dobila ime po molekularnem biologu Robinu Hollidaju, ki je tudi prvi predlagal obstoj take strukture leta 1964, saj naj bi takrat razložil premestitev genov med kromsomi. Štiri roke takega sklopa se lahko tudi premikajo preko zanke, dokler se ne vzpostavi pravilno parjenje baz. Če je sekvenca baz nesimetrična se tak spoj zablokira. V okolju, ki vsebuje majhne koncentracije ionov se, Hollidajeva zanka nahaja v odprti konformaciji, v okolju z večjo koncentracijo ionov pa v snopasti obliki. Hollidajeva zanka je ključni intermediat pri homologni rekombinacij. Prispeva k večji genski raznolikosti, ker se pri rekombinaciji spremeni pozicija določenih genov med kromosomoma. Hollidejevo zanko določeni encimi lahko tudi razgradijo oz. podrejo. Ti so lahko tudi specifični, glede na sekvenco, ki jo prepoznajo. Encimi delujejo na različne načine: lahko spremenijo kot, pod katerim so povezane štiri roke, lahko razgradijo centralni spoj Hollidajeve zanke, nekateri pa vplivajo na premestitev (crossover).

Razrešitev Hollidayeve zanke

Hollidajevo zanko pri evkariontih stabilizirajo proteini podobni prokariontskim RuvABC. Da nastaneta dve novi DNA se morata zanki razrezati na obeh straneh. Prekinitev vezi povzroči endonukleaza, ki prepozna specifično nukleotidno zaporedje, se veže na zanko in jo pretrga. Nastaneta lahko dve nepoškodovani DNA na več načinov, saj se Hollidajeva zanka lahko razklene na več načinov. Če se oba spoja prelomita horizontalno, novonastala DNA vsebuje isti verigi, kot pred prelomom in novo sintetiziran segment. Če pa na eni strani pride do prekinitve horizontalno, na drugi pa vertikalno, se DNA segmenta zamenjata na obeh straneh preloma dvojne vijačnice. Tak način zamenjave dela DNA imenujemo premestitev . Novo nastala DNA vijačnica, je tako sestavljena iz dela, ki je pripadal DNA vijačnici, na kateri je prišlo do preloma in dela homologne DNA, na podlagi katere je nastala D-zanka. Lahko pa se v proces vključijo tudi helikaze, ki zmanjšujejo Hollidajevo zanko. Pri tem nastane DNA brez prekižanja. Napake homologne rekombinacije celice čim prej popravijo, če do teh pride. Dvojna rekombinacija je pa celično kontroliran proces s popravljalnimi mehanizmi, vendar se lahko vseeno kaj zaplete, kar je lahko usodno za celico.

Viri

1. B.E. Tropp: Principles of Molecular Biology, 1. izdaja. Burlington: Jones & Bartlett Learning, 2014.

2.Kowalczykowski, S. C. An Overview of the Molecular Mechanisms of Recombinational DNA Repair. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 1–37 (2016). doi:10.1101/cshperspect.a016410

3.Nimonkar, A. V. et al. BLM-DNA2-RPA-MRN and EXO1-BLM-RPA-MRN constitute two DNA end resection machineries for human DNA break repair. Genes Dev. 25, 350–362 (2011).

4.Pâques, F. & Haber, J. E. Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63, 349–404 (1999).

5.Zhang, F. et al. PALB2 Links BRCA1 and BRCA2 in the DNA-Damage Response. Curr. Biol. 19, 524–529 (2009).