TBK2017 Povzetki seminarjev

Nazaj na osnovno stran

Ana Scott: Naslov seminarja

Tekst ....

Patrik Levaćić: Prehrambni aditivi v sladkarijah ter žvečilnih gumijih lahko spremenijo funkcionanlnost in strukturo prebavnih celic

Vnos nano delcev titanovega dioksida (TiO2) preko prehrambenih izdelkov kot so sladkarije ter žvečilni gumiji je praktično nemogoče. Prebavni trakt služi kot pomembna meja med telesom in zunanjim okoljem. Cilj raziskave je bilo opazovanje posledic vnosa 30 nano meterskih delcev titanovega dioksida preko modela celične strukture tankega črevesja ter določitev kako akutna ter kronična izpostavljenost takim delcem lahko vpliva na funkcionalnost in strukturo celice. Postopek prepoznavanja TiO2 delcev je zelo kompleksen, navadno se uporablja Ramanova spektroskopija, ki izkorišča lastnosti molekule kot so vibracijska ter rotacijska stanja, s tem pa dobimo tako imenovani finger-print molekule, saj ima vsaka molekula svoje lastnosti in se po njih loči od drugih molekul. Rezultati raziskave so potrdili, da čeprav akutna izpostavljenost ni pustila resnejših posledic na celični strukturi, ima kronična izpostavljenost kar nekaj posledic na celičnem nivoju. Spremeni se funkcionalnost celice, nivo delovanja membranskih encimov vpade, spremeni se prav tako tudi struktura, saj se zmanjša sposobnost vsrkavanja nutrientov preko mikrovilov.

Tina Turel: Povezanost retrovirusov z razvojem možganov

Možgani človeka so bistveno bolj razviti od možganov drugih sesalcev in zato veliko težji za raziskovanje in razumevanje. Številne raziskave so dokazale, da bi transportni elementi (TE-ji), ki so še pred nekaj leti veljali za neuporaben del DNA, tako imenovan »junk DNK«, lahko bili odgovorni za današnjo stopnjo razvitosti človeških možganov. Retrovirusi so posebna skupina virusov. Nekateri veljajo za škodljive (HIV), drugi pa so povsem neškodljivi. V našem DNA je več kot 1000 različnih retrovirusov. V raziskavi, ki jo je vodil Johan Jakobsson in se je odvijala v Lundu, so dokazovali pomembno vlogo ERV-ja, endogenega retrovirusa v razvoju človeških možganov. Želeli so pokazati, da nekaj tisoč ERV-jev, mnogi so primarno specifični, delujejo kot priklopna podlaga za epigenetske represorsko beljakovino TRIM28, ki vzpostavi lokalni hetero kromatin okoli ERV-jev. Retrovirusi lahko pri vsakem človeku reagirajo drugače, saj so tak tip genetskega materiala, da se lahko nahajajo v katerem koli delu v genomu. Različna izražanja ERV-ja pa bi bila lahko tudi razlog za možganske okvare, ki povzročijo bolezni, kot so ALS, shizofrenija in bipolarna motnja .

Nina Mezgec Mrzlikar: Regulacija gena DISC-1 kot potencialnega zdravila za shizofrenijo

Shizofrenija je duševna motnja, ki se razvije v zgodnjem odraslem obdobju. DISC-1 (Disrupted-In-Schizophrenia-1) je protein, kodiran z genom DISC-1 in je močno izražen v možganskem hipokampusu. Sodeluje pri razvoju aksonov in povezovanju celic. Caveolin-1 je ogrodni protein bistven pri regulaciji receptorjev na membranah in spodbuja razvoj novih povezav med živčnimi celicami. V tej raziskavi so znanstveniki proučevali vpliv proteina Cav-1 na izražanje gena DISC-1 v živčnih celicah. Ugotovljeno je bilo, da prekomerno izražen gen Cav-1 povzroči večje izražanje gena DISC-1 in drugih sinaptičnih proteinov, ki so potrebni za prenos živčnega signala. V miših, katerim so iz hipokampusa odstranili Cav-1 je posledično prišlo do manjšega izražanja DISC-1 in hkrati drugih sinaptičnih proteinov. Izguba Cav-1 torej zmanjšuje aktivnost sinaps, kar pa je vzrok za številne nevrodegenerativne bolezni, kot je tudi shizofrenija. Ugotovitve kažejo na pomembno vlogo proteina Caveolin-1 v celicah, saj vzdržuje pravilno delovanje receptorjev in s tem prenos živčnega signala.

Sonja Gabrijelčič: Ribosomske mutacije spodbujajo razvoj odpornosti proti antibiotikom v okolju z več zdravilnimi učinkovinami

Odpornost bakterij na antibiotike je v porastu po vsem svetu. Pojavlja se tako v državah v razvoju, kjer je predvsem posledica nekvalitetnih antibiotikov, kot v najrazvitejših državah sveta, kjer se pojavlja več in več patogenov, ki lahko preživijo v okolju z več zdravilnimi učinkovinami oziroma antibiotiki. Bakterije lahko pridobijo odpornost ali z izmenjavo mobilnih genetskih elementov ali z mutacijo genetskega materiala, ki je že v celici. V raziskavi, ki jo opisuje članek, so raziskovalci želeli opazovati slednje, zato so izmed bakterij, ki so lahko sočasno odporne na več antibiotikov, izbrali Mycobacterium smegmatis, sorodnico bakterije, ki povzroča tuberkulozo, in eno od predstavnic skupine bakterij, pri kateri do izmenjevanja plazmidov praktično ne pride. Klasificirali so tipe mutacij, do katerih je prišlo, in se osredotočili predvsem na mutacije, ki so se zgodile na mestih genoma, kjer se kodirajo proteini, ki so sestavni deli ribosomov. Ugotovili so, da so taki mutanti odporni na antibiotike z različnimi mehanizmi delovanja, ki jim niso bili še nikoli izpostavljeni, na antibiotike širokega spektra in poleg tega tudi na nekatere druge mehanske strese na membrane.

Daria Latysheva: Mehanski raztezek sproži hitro delitev epitelijskih celic

Mehansko aktivni kanalčki so membranski proteini, ki so neposredno odvisni od sile in pretvarjajo mehanske držljaje v električne oz. biokemijske signale. Piezo1 je mehansko aktiven ionski kanalček, ki spodbuja celično smrt v predelih z visoko gostoto celic. V raziskavi so ugotovili, da kotrolira tudi mitotsko delitev. Raziskali so mehanizem delovanja Piezo1 v procesu celične delitve. Pri nizki gostoti celic oz. kjer so celice raztegnjene se Piezo1 lokalizira na celični membrani ter se odpre; posledično sproži influks kalcija v celico. ERK1 se aktivira zaradi povečane koncentracije Ca2+ ionov, kar vpliva na aktivnost ciklina B v G2 fazi mitotske delitve in povzroči proliferacijo. Način, na kateri Piezo1 aktivira dva nasprotna procesa je odvisen od lokacije in načina aktivacije kanalčka. V predelih z nizko gostoto celic se Piezo1 lokalizira na celični membrani ter hitro aktivira celično delitev. Če so celice razporejene tesno druga ob drugi, se Piezo1 oblikuje v velike citiplazemske agregate in spodbuja celično smrt. Zaradi sposobnosti zaznave mehanskega raztezka ter prevelike in premajhne gostote celic Piezo 1 deluje kot homeostatski senzor in kontrolira število epitelijskih celic.

Nika Goršek: Nove študije razkrivajo delovanje molekulske črpalke, ki izloča zdravila proti raku

MRP1 ali »Multidrug resistance protein« je protein, ki spada v družino ABC-transporterjev. Pomemben je pri reguliranju redoks homeostaze, vnetij in sekrecije hormonov. Znano je tudi, da ima pomembno vlogo pri odpornosti na zdravila in njihovem črpanju iz celic. V raziskavi na univerzi Rockefeller so z uporabo elektronske kriomikroskopije določili njegovo zgradbo. Sestavljajo ga štirje glavni deli: dva transmembranska dela, ki tvorita telo transporterja, dva dela, ki vežeta ATP, motiv v obliki lase in N-terminalni transmembranski del. Čeprav ima MRP1 dva dela, ki bi lahko vezala ATP, pa tega veže le en, saj pri drugem delu pride do drugačnega zaporedja aminokislin. V raziskavah so dokazali, da mutacije določenih delov proteina vodijo v bolezenska stanja in da bi sprememba le ene aminokisline v zaporedju vplivala na aktivnost proteina. MRP1 ima le eno dvojno vezavno mesto, ki je pozitivno nabito. Pestrost substratov je zaradi takega vezavnega mesta veliko večja, kot pri nekaterih drugih znanih proteinih. Prenaša lahko organske, amfipatične in aninonske molekule, na primer zdravila proti raku, opijate, antidepresive in tudi nekatere za življenje pomembne snovi (hormoni in protivnetne molekule). Ob vezavi substrata se oblika proteina MRP1 spremeni, aktivnost pa se poveča. Po končanem transportu pa protein preide nazaj v prvotno, neaktivno obliko.

Dragana Savković: Stopnja preživetja evkariontskih celic po elektroforezni nanoinjekciji

Znotrajcelična dostava makromolekul je pomemben korak za terapevtske in raziskovalne namene. Za uvajanje tujih molekul v citoplazmo živih celic uporabljale so se metode, katere so se v večini primerov uporabljale za veliko število celic v kulturi in je splošno znano, da veliko število teh celic (do 50%) ne preživi ta proces. Da bi rešili ta problem, razvili so alternativno metodo znotrajcelične dobave, oziroma znotrajcelično elektroforezno nanoinjekcijo. V raziskavi so primerjali stopnjo preživetja celic injiciranih z pipeto s premerom 100 nm in pipeto s premerom 500 nm. Ugotovili so, da je stopnja preživetja z uporabo 100 nm pipeto veliko večja kot s 500 nm pipeto in tudi da ostale preživele celice kažejo bolj naraven cikel celic.

Urška Zagorc: Proteini, zgodnje opozorilo sladkorne bolezni tipa 1

Sladkorna bolezen tipa 1, ki je značilna predvsem za otroke in mladostnike, je posledica motnje v imunskem sistemu. Organizem uniči lastne celice v trebušni slinavki, ki proizvajajo inzulin. Ta omogoča glukozi iz hrane vstop v celico, s čimer celica dobi hrano in energijo. V raziskavi nemškega raziskovalnega centra za zdravje in okolje Helmholtz Zentrum München so sodelovali otroci, katerih ožji družinski član ima diabetes tipa 1 in otroci brez dednih dispozicij. Analizirali so krvne vzorce otrok z avto-protitelesi ter jih primerjala z vzorci otrok, ki ne kažejo znakov bolezni niti nimajo protiteles.Identificirali so 41 peptidov iz 26 proteinov, ki se razlikujejo v krvnih vzorcih tistih otrok s protitelesi in tistih brez. Glede na koncentracijo peptidov v treh proteinih (hepatocitni rastni faktor HGF, istem komplementa H in ceruloplazmin) in glede na starost otroka, so dosegli tudi boljšo oceno hitrosti razvoja bolezni. Večja koncentracija sistema komplementa H in hepatocitnega rastnega faktorja ter nižja koncentracija ceruloplazmina pri tem nižji starosti bolnika, pomenijo hitrejši napredek bolezni. Identificirani proteini nam pokažejo bolj natančno oceno stopnje pred pojavom simptomov. Zaradi njih je možno tudi ugotoviti ali ima bolnik s protitelesi, večjo ali manjšo možnost za razvoj sladkorne bolezni tipa 1 in kako hitro se bo bolezen razvila.

Anja Černe: Uporaba askorbata pri zdravljenju raka

Če askorbat vnesemo v organizem v manjših koncentracijah ima antioksidativne učinke, medtem ko se pri vnosu v večjih koncentracijah obnaša kot prooksidant. Farmakološko koncentriran askorbat povzroča tok izvenceličnega H2O2 v celico in vse celice, tako zdrave kot rakave, encimsko razgrajujejo H2O2, ki je zanje toksičen. Glavni encimi, ki razgrajujejo H2O2 pri velikih količinah so katalaze. Ker pa je katalaz v rakavih celicah malo, so rakave celice bolj dovzetne škodljive učinke, zato je askorbat zanje selektivno toksičen. Katalazna aktivnost v rakavih celicah lahko napove, kako se bo tumor odzval na terapijo z askorbatom. Pri nekaterih vrstah tkiv je rast tumorjev bolj upočasnjena, pri drugih manj (odvisnost od količine katalaz, ki jih tkivo vsebuje). Število aktivnih katalaznih monomerov na celico in ED50 (koločina snovi, ki učinkuje pri 50% osebkih) sta sorazmerna s konstanto celične razgradnje H2O2. Radikali, ki nastanejo pri reakciji med ionom kovine in H2O2, poškodujejo DNA, v kolikšni meri se to zgodi pa je odvisno od količine askorbata.

Jerneja Nimac: S CRISPR/Cas9 nad X-vezavno kronično granulomatozno bolezen

Kronična granulomatozna bolezen je dedna bolezen imunskega sistema, ki nastane zaradi mutacije v genu CYBB, ki kodira gp91phox. Slednji je katalitični center NADPH oksidaze 2 (NOX2), ki ima pomembno vlogo pri obrambi organizma pred okužbami. Mutacije v genu CYBB na kromosomu Xp21.1 pa so odgovorne za X-vezavno obliko kronične granulomatozne bolezni. Za popravljanje takšne monogenske mutacije so v raziskavi uporabili sistem CRISPR/Cas9. Ta sistem so za obrambo pred virusnimi okužbami razvile bakterije in arheje, gre pa za poseben od RNA odvisen sistem pridobljene imunosti, ki specifično prepozna in reže tujo tarčno DNA. V raziskavi so skušali s sistemom CRISPR/Cas9 popraviti mutacijo C676T na eksonu 7 gena CYBB. Z DHR testi so ugotovili, da s CRISPR/Cas9 popravljene mieloične celice obnovijo aktivnost NOX2 in ponovno izražajo protein gp91phox. S spreminjanjem količine ssODN pa so dokazali, da je stopnja popravljenih genov večja, če je količina ssODN večja, delež indelov pa se zmanjša. Prav tako so potrdili uspešno presaditev s CRISPR/Cas9 popravljenih krvotvornih matičnih in predniških celic in njihovo diferenciacijo v nepoškodovane mieloične in limfocitne celice v NSG miših v obdobju petih mesecev.

Barbara Slapnik: Holesterol v celični membrani

Holesterol je razporejen po celični membrani. Pomemben je za vzdrževanje membranske fluidnosti, membrano naredi bolj togo in manj prepustno. Njegova porazdelitev med zunanjim in notranjim fosfolipidnim slojem pa ni enakomerna. V raziskavi so razvili dopolnilne senzorje, ki omogočajo vpogled holesterola v obeh slojih sočasno in določili njegovo točno koncentracijo. Ugotovili so, da je koncentracija holesterola v zunanjem sloju celične membrane znatno višja kot koncentracija v notranjem sloju. Visoka koncentracija holesterola v zunanjem sloju celične membrane zmanjša njeno prepustnost, medtem ko nizka koncentracija holesterola v notranjem sloju omogoča celično sporočanje. Rezultati prikazujejo pomen transbilarne asimetrije holesterola v celični membrani in njegovo prerazporeditev za celično homeostazo, rast in razmnoževanje. Podajajo tudi povezavo med holesterolom v notranjem sloju celične membrane in rakom. Določili so točno koncentracijo holesterola, kar jim omogoča boljšo diagnostiko in zdravljenje raka, vendar so za to potrebne še nadaljnje raziskave. Rezultati prav tako predstavljajo osnovo za nadaljnje študije transbilarne dinamike in funkcij holesterola in drugih lipidov v celici.

Nadja Škafar: Dostava protitumorskih zdravil s pomočjo makrofagov in biorazgradljivih nanodelcev

Nanotehnologija igra pomembno vlogo v moderni medicini, še posebej na področju zdravljenja bolezni s tarčno dostavo zdravil. Glavna prednost nanodostavnih sistemov (NS) pred danes uveljavljenimi metodami zdravljenja raka je selektivna dostava protitumorskih učinkovin tumorskim celicam, kar zmanjša možnost pojava neželenih stranskih učinkov, s tem pa se bolniku omogoči boljša kakovost življenja med in po zdravljenju. Dosedanje raziskave na področju NS so temeljile na injiciranju nanodelcev v krvni obtok. Ker pa ob vnosu nanodelcev v telo prihaja do medsebojnega delovanja NS s celicami imunskega sistema, jih te, še preden lahko nanodelci dostavijo zdravila do željenega mesta, odstranijo s fagocitozo. Raziskovalca Jian Yang in Cheng Dong sta zato s svojo ekipo skušala razviti novo tehniko NS, ki problematiko reakcij med NS in makrofagi v bioloških sistemih odpravi tako, da makrofage uporablja kot nosilce nanodelcev do tumorskih celic. Rezultati so pokazali, da so lahko makrofagi uspešni nosilci nanodelcev ter da bi lahko bili NS takšnega tipa v prihodnosti uspešna metoda za zdravljenje številnih bolezni.

Špela Deučman: Raziskovanje vzrokov kronične zavrnitve presajenih pljuč

Pri presajenih organih je največja skrb zavrnitev, ki je lahko akutna ali kronična. Pri slednji presadek sčasoma izgubi funkcijo in odmre, kar lahko povzroči smrt prejemnika. Stopnja preživetja presaditve pljuč je nižja od vseh ostalih presaditev organov. Pri 50% pacientov se pojavi obliterantni bronhiolitis oz. BOS, ki je glavni razlog kronične zavrnitve pljuč. Namen raziskave je bil odkriti signalno pot med NFAT1 (transkripcijski faktor), β-cateninom (koregulator transkripcije), ATX (eksoencim) in LPA1 (receptor) oz. LPA (sporočevalec) ter predlagati potencialno terapevtsko vlogo LPA1 antagonistov ter ATX inhibitorjev z namenom, da bi preprečili BOS. Odkrili so pozitivno korelacijo ekspresije med β-cateninom in kolagenom I. Ker LPA prepreči razgradnjo aktivnega β-catenina in ker je za nastanek LPA odgovoren ATX, so raziskali mehanizme reguliranja ekspresije ATX. Ugotovili so, da ekspresijo ATX regulira transkripcijski faktor NFAT1. Znano je, da LPA povečuje znotrajcelično koncentracijo prostih Ca2+ ionov, ti pa so povezani z aktivacijo in jedrsko translokacijo NFAT1. To pomeni, da LPA regulira ekspresijo NFAT1 in posledično tudi ATX. Pri raziskovanju na miših so uporabili LPA1 antagoniste in ATX inhibitorje, ki so vidno zmanjšali napredek BOS.

Anže Jenko: Koriščenje kemiluminiscence dioksietanovih sond za prikazovanje celice

Kemiluminiscenčne sonde veljajo za eno izmed najbolj občutljivih diagnostičnih metod pri določanju encimske aktivnosti in koncentracije analita, kar v praktičnem življenju denimo koristi forenzikom. Ker pa je splošno uveljavljen princip koriščenje kemiluminiscence slabo dodelan in privede do velikih energetskih izgub. Raziskovalci so tako v sami raziskavi preizkušali kemiluminiscenčne in fluorescenčne lastnosti različnih derivatov Schaapovega adamatiliden-dioksetana, na katerega so vezali različne substituente, ki pa so imeli znaten vpliv. Na ta način so želeli ustvariti enokomponentni sistem, z visoko intenziteto izseva, ki pa je tudi primeren v fizioloških razmerah. To jim je na koncu tudi uspelo. Na najbolj ustrezni izmed sintetiziranih sond, so hidroksilno skupino na benzenovem obroču zamaskirali z drugačnimi zaščitnimi skupinami. Vsaka izmed teh skupin pa je bila občutljiva na različne molekule (denimo beta-galaktoza na encim beta-galaktozidaza), reakcija s katerimi je povzročila destabilizacijo - vzbujeno stanje sonde in posledično kemiluminiscenco. Ta mehanizem je pokazal visoko mero selektivnosti, zato so ga lahko praktično koristili pri mikroskopskem prikazovanju celic. Pri celicah z genom za prekomerno izražanje beta-galaktozidaze je z uporabo relavantne sonde (ustrezna zaščitna skupina) prišlo do obarvanja, pri takšni, kjer pa tega encima ni bilo prisotnega, pa do obarvanja ni prišlo.

Jana Kotnik: Sintetični membranski receptorji

Znanstveniki na Univerzi Bristol so našli način za posnemanje sporazumevanja celic z okolico. Ustvarili so sintetični receptor, ki se odziva na kemične signale podobno kot njegova naravna ekvivalenta. Vsadijo se v membrano in so sposobni vezave določenih ligandov. Receptor je sestavljen iz 3 delov: Vezavnega žepka konstruiranega iz kationskega kovinskega kompleksa, hidrofobne oligomerne vijačnice (jedro receptorja) in sonde s pirensko fluorescenco. V raziskavi so na podlagi sevanja sonde preučevali vpliv kiralnih ligandov na receptor in njegovo obliko v topilu ter v umetnih membranah veziklov. Umetni receptorji ponujajo redko možnost primerjanja obnašanja (oblike) molekul v raztopini in v membrani ter priložnost raziskovanja učinka membrane na razporeditvene preference in vezave ligandov. Kontroliranje prenašanja biokemijskih informacij čez fosfolipidni dvosloj predstavlja veliko priložnost za razvoj sintezne biologije - predstavljamo si lahko npr. umetne celice, s katerimi bi z nadzorovanjem receptorjev v membranah proizvajali koristne materiale ali zdravila.

Andrej Špenko: Nova tehnika za regeneracijo kostnega tkiva

Ruski znanstveniki so odkrili učinkovit način za izdelavo mineraliziranih vlaken, ki so mehansko odporna in hkrati celicam nudijo ugodne pogoje za preživetje. Vlakna, ki so bila narejena z elektrostatskim sukanjem, da so čim bolj posnemala človeški matriks, so potopili v raztopino Na2CO3 in CaCl2. Na vlaknih so se je tako formirali kristali CaCO3, katerih oblika pa je bila zelo odvisna od pogojev, v katerih so nastali. Pri nadaljnjih poskusih so raztopine z ogrodjem obdelali z ultrazvočnim valovanjem, da so ioni prodrli tudi v spodnje sloje ter v sredino vlaken. Ugotovili so, da se s pomočjo ultrazvočnega obdelovanja v prvih 30 sekundah formira vaterit, nestabilna oblika kristalov CaCO3, ki vlakna v nekaj kratkih ponovitvah popolnoma obda. Pri kasnejših ponovitvah pa se formira kalcit, ki pa je bolj pravilen in mehansko odporen kot vaterit. Če bi vlakna pustili v raztopini za daljše časovno obdobje, bi imel kalcit čas, da se formira. To bi pomenilo manjšo mehansko obstojnost, saj bi se na vlaknih raje formirali pravilni kristali, kot pa da bi vlakna obdali in tako pripravili enakomeren sloj okoli vlaken, na katere bi se kasneje zlagali dodatni kristali. Znanstveniki so v dokončana vlakna položili človeške kožne celice in po treh dneh so testi pokazali, da je sposobnost preživetja celic skoraj enaka tisti, v kontroli.

Ana Maklin: Analiza razvijanja proteinov v celici razkriva faktorje termične stabilnosti proteinov

Temperatura ima velik vpliv na fiziologijo celice. Organizmi rastejo najbolj optimalno le v omejenih temperaturnih razsežnostih. Občutljivost na temperaturo je v veliki meri posledica vpliva temperature na strukturo in funkcijo proteinov. Leuenberg et al. so opazovali termično stabilnost proteinov, z uporabo postopka LiS-MS, ki omogoča preučevanje proteinov neposredno v celičnem matriksu. Postopek so uporabili na Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Thermus thermophilus in človeških celicah, pridobili pa so podatke za več kot 8000 proteinov. Med raziskavo so prišli med drugim do naslednjih spoznanj: (i) do temperaturno sprožene celične smrti pride zaradi izgube določenih proteinov s ključnimi funkcijami, (ii) stabilnost nekaterih proteinov je posledica evolucijskega ohranjanja, (iii) dolžina proteinov in njihova termična stabilnost sta v obratnem sorazmerju, (iv) proteini, manj podvrženi termični agregaciji, so stabilnejši, (v) stabilni proteini imajo več beta ploskev, nestabilni pa alfa vijačnic.

Luka Gregorič: Merjenje količine urina v plavalnih bazenih s pomočjo merjenja koncentracije umetnih sladil

Uriniranje v bazene povzroča precej preglavic veliko lastnikom bazenov in tudi njihovim obiskovalcem. Zato se raziskovalci že dolgo trudijo ugotoviti učinkovit način s katerim bi lahko nadzirali koncentracijo urina v bazenih, da bi lahko se tudi lažje in bolj učinkovito spopadli z razkuževanjem le tega. Zato so začeli meriti vsebnost umetnega sladila ACE (acetilsulfam-K), ki se pojavlja v človeškem urinu in je zelo odporen na zunanje dejavnike (na velike spremembe pH in temperature). Hkrati pa je njegove koncentracije v podtalnici relativno malo, tako da velika odstopanja le tega ne moremo pripisati zunanjim dejavnikom. Koncentracija ACE v urinu je 4000 μg/L. Testirali so 21 različnih bazenov in 8 vročih vrelcev v Kanadi. Zbiranje vzorcev je trajalo 3 tedne. Testirali so jih skupaj z praznim vzorcem in ugotovili, da ima voda v bazenih in vročih vrelcih veliko večjo koncentracijo ACE kot prazen vzorec (ki je imel koncentracijo 0 ng/L) in podtalnica (10 ng/L). Te koncentracije so imele razpon vse od najmanjših vrednostih 50 ng/L do 7100 ng/L v vročih vrelcih. Ker v bazenih ni nobenega drugega očitnega vira ACE kot človeški urin so zaključili, da je v tistih bazenih, ki vsebujejo več ACE, tudi koncentracija urina večja.