Proti antibiotikom odporne mikobakterije in nejserije

Uvod

Odpornost patogenih mikroorganizmov na vse vrste antibiotikov v zadnjem času za medicino in sorodne vede predstavlja vse večji problem. Med te patogene mikroorganizme spadajo tudi mikobakterije in nejserije, rodova bakterij, med katere spadajo povzročitelji hudih bolezni kot so tuberkuloza, gobavost, gonoreja in meningitis. Mikobakterije so rod paličastih bakterij. Najbolj znana predstavnika sta M. tuberculosis in M. leprae, ki povzročata tuberkulozo in gobavost. Najdemo jih v vodi, zemlji in v tkivih okuženih živali. Imajo zelo značilno celično steno, ki vsebuje precej nenavadne kompleksne lipide, ki jim pravimo mikolične kisline. Zaradi počasnega deljenja in trdovratnosti mikobakterij so bolezni dolgotrajne in zahtevajo zdravljenje. Tradicionalno bolezni, ki jih povzročajo, zdravimo z aminoglikozidnimi antibiotiki, vendar pa zaradi evolucijsko pridobljene odpornosti nekaterih sevov danes to ni več mogoče. Nejserije pa so rod gram-negativnih kokov. Ime so dobile po njihovem odkritelju, nemškemu bakteriologu Albertu Neisserju. Obstaja jih več vrst, za človeka nevarna pa sta N. gonnorrhoeae in N. meningititis, ki povzročata gonorejo in meningitis. Zadnjih 70 let se jih zdravi s penicilinom ali drugimi betalaktamskimi antibiotiki, v zadnjih letih pa to ni več vedno učinkovito. Ker sta bakterijski meningitis in gonoreja bolezni, ki se pojavljata povsod po svetu, tudi v državah, kjer z antibiotiki ravnajo manj skrbno, se bo problem neozdravljivih oblik bolezni meningitisa in gonoreje najverjetneje še povečal.

Odpornost N. gonorrhoeae na antibiotike

Številne študije na N. gonorrhoeae so pokazale, kako se bakterije spopadajo z antibiotiki in kakšni so mehanizmi antimikrobne odpornosti.

N. gonorrhoeae je s številnimi raznolikimi mutacijami sposobna spremeniti svoj genetski material tako, da se prilagodi na svoje okolje. Sevi N. gonorrhoeae so odporni na antibiotike, ki spadajo med peniciline, sulfonamide, tetracikline, spektomicine, kinolone, makrolide in cefalosporine.

Odpornost na penicilin je posledica mutacije na genu penA, ki zapisuje protein PBP2 (penicillin binding protein 2), ki je glavna tarča penicilina. Mutacija povzroči vključitev dodatne aminokisline (D345) v proteinsko zaporedje v bližini C-konca. Ta mutacija zmanjša vezavo penicilina na PBP2 in onemogoči acetilacijo proteina. Mutacije na mtrR (multiple transferable resistance repressor) pa povzročijo povišano izražanje odtočne črpalke MtrCDE. Vloga črpalke MtrCDE je varovanje celice in izvažanje antimikrobnih ter hidrofobnih sredstev, ki celico lahko poškodujejo ali celo ubijejo. Povišana koncentracija MtrCDE lahko tako učinkoviteje odstranjuje peniciline iz celice.

Odpornost na kinolone je posledica mutacije na t.i. regiji QRDR (quinolone resistance-determening region) gyrA in parC. V primeru gyrA se namesto aspartata na mestu 95 v protein vgradi asparagin oziroma glicin, kar zmanjša možnost vezave kinolonov na DNA-girazo. Tudi pri parC pride do zamenjave posameznih nukleotidov, kar povzroči prevajanje mRNA v nepravilno aminokislinsko zaporedje. Posledica mutacije parC je manjša vezavnost kinolonov na topoizomerazo IV.

Odpornost na tetracikline je posledica mutacije SNP na genu rpsJ, ki kodira za ribosomalni protein S10. Mutacija povzroči rahlo spremembo konformacije S10, kar zniža afiniteto tetraceklinov do vezave na 30S podenoto ribosoma. Pojavijo se tudi mutacije na mtrR in penB, ki sta prav tako tarči tetraciklinov. Odpornost se lahko pojavi tudi zaradi transformacije seva. Če celice vsebujejo TetM-kodirajoči plazmid, se v celicah začne izražati TetM (tetracycline resistance protein). TetM je analog EF-G (elongacijski faktor G) in se lahko veže v 30S podenoto ribosoma in s tem sterično ovira vezavo tetraciklina na malo ribosomalno podenoto.

Odpornost mikobakterij proti antibiotikom

Zdravljenje okužb z mikobakterijami (npr. tuberkuloze) je zelo dolgotrajno, zato se veliko bolnikov ne drži predpisane terapije. To pa lahko zelo hitro privede do odpornosti, saj bakterije, ki razvijejo določeno mero odpornosti, lahko preživijo in jo razvijajo naprej. Mikobakterije so tako razvile številne mehanizme obrambe pred antibiotiki, od genetskih mutacij do črpanja antibiotikov iz celice. Še posebej zanimiva je njihova pasivna odpornost zaradi posebne celične stene, ki je zgrajena iz različnih slojev. Mikobakterije sicer uvrščamo med grampozitivne bakterije, a je njihovo steno precej težje preiti. V spodnji plasti se nahajata hidrofilna peptidoglikan in arabinoglikan, nanju pa je kovalentno vezana hidrofobna mikolična kislina. Tako stena preprečuje vstop tako hidrofobnih kot hidrofilnih molekul, kar bakteriji pomaga pri obrambi pred antibiotiki. Mikobakterije se delijo zelo počasi, zato se lahko v celicah kljub slabemu prehajanju skozi steno nabere dovolj antibiotika, da ima ta inhibitoren učinek. Mehanizmi odpornosti proti antibiotikom so najbolje raziskani pri povzročitelju tuberkuloze, M. tuberculosis, zato si bomo v nadaljevanju podrobneje pogledali, kako na to vrsto bakterij vpliva pirazinamid in kako so se bakterije pred njim zavarovale.

Mehanizem delovanja pirazinamida in odpornost M. tuberculosis

Pirazinamid je eden od številnih antibiotikov, ki jih uporabljamo za zdravljenje tuberkuloze. Kljub temu da spada med bolj uporabljene antibiotike, so bili njegovo delovanje in mehanizmi odpornosti nanj do nedavnega neznani. Pirazinamid se, tako kot nekateri drugi antibiotiki, ki se uporabljajo za zdravljenje tuberkuloze, uporablja v pro obliki. To pomeni, da ga mora na tarčnem mestu encim pretvoriti v njegovo aktivno obliko, pirazinojsko kislino. Encim, ki ga vsebujejo mikobakterije in je za pretvorbo odgovoren, se imenuje pirazin-amidaza. Zapisuje jo gen pncA. Odkrili so, da zmanjšana aktivnost tega encima povzroči odpornost, povečano izražanje pa poveča učinek pirazinamida. Pri pregledovanju genomov odpornih bakterijskih sevov so ugotovili, da ima večina mutacije na genu pncA, odkrili pa so tudi nekaj sevov, ki take mutacije niso imeli. Ugotovili so, da imajo ti sevi mutacijo na genu rpsA, ki zapisuje protein S1 male podenote ribosoma (RpsA). Z določanjem zaporedja tega gena so določili, da pride do izbrisa treh baznih parov, kar pri RpsA povzroči izgubo alanina 438 na C-koncu. Protein RpsA sodeluje pri trans-translaciji. V stresnem okolju pride do zastajanja ribosomov. S trans-translacijo bakterija poskrbi, da se zastali ribosom reciklira, mRNA in nedokončani protein pa razgradita. Do tega pride, ko se namsto tRNA na zastali ribosom veže tmRNA. Ta ima značilnosti tako tRNA kot mRNA. Na ribosom se veže v kompleksu skupaj z alanilom, SmpB (RNA-vezavni protein) in EF-Tu. Prevajanje nato poteka na osnovi tmRNA, to pa povzroči, da se na C-konec proteina doda oznaka, ki jo zapisuje tmRNA. Označen protein in mRNA se nato razgradita in ribosom se sprosti. Protein RpsA ima v procesu pomembno vlogo, saj se veže na tmRNA in tako zagotovi, da je proces uspešen. Če se nanj veže pirazinojska kislina, ne pride do pravilne interakcije med RpsA in tmRNA in proces trans-translacije je zaustavljen. Tako pride do zmanjšanja števila ribosomov, ki so na voljo za prevajanje, hkrati pa tudi do kopičenja škodljivih nedokončanih proteinov. Ugotovili so, da mutirani RpsA v normalnih pogojih slabše vežejo tmRNA, zato je proces trans-translacije zmanjšan. Ko je prisoten pirazinamid, pa nemutirani proteini povsem izgubijo sposobnost vezave tmRNA, medtem ko mutirani sposobnost vezave ohranijo. Tako bakterija izniči učinek antibiotika.

Zaključek

Na antibiotike odporni patogeni predstavniki nejserij in mikobakterij tako predstavljajo za zdravstvo velik izziv. Zaradi pogostosti in resnosti bolezni, ki jih povzročajo ter velike sposobnosti nejserij za manipuliranje z lastnim genetskim materialom, je razvoj novih antibiotikov in skrbno ravnanje z že obstoječimi velikanskega pomena, če naj se izognemo širjenju neozdravljivih bolezni, ki se lahko končajo tudi usodno. Skrb vzbujajoči sta predvsem gonoreja, ki se z lahkoto širi in je že danes lahko odporna na širok spekter antibiotikov ter tuberkuloza s katero je po nekaterih podatkih okužena kar tretjina svetovnega prebivalstva in se nezdravljena v približno polovici primerov, v katerih se razvije bolezen, konča s smrtjo. Dejstvo, da do večine okužb pride v državah, kjer je nadzor nad uporabo zdravil premajhen pa problem še oteži.

Viri

Morse, S. A. Neisseria, Moraxella, Kingella and Eikenella. Medical Microbiology (University of Texas Medical Branch at Galveston, 1996).

Smith, T., Wolff, K. A. & Nguyen, L. Molecular biology of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 374, 53–80 (2013).

Shi, W. et al. Pyrazinamide inhibits trans-translation in Mycobacterium tuberculosis. Science 333, 1630–2 (2011).

Unemo, M., Shafer, W. M. Antimicrobial Resistance in Neisseria gonorrhoeae in the 21st Century: Past, Evolution, and Future. Clinical Microbiology Reviews. (2014). doi: 10.1128/CMR.00010-14

Hogg, S. (2005). Essential Microbiology. University of Glamorgan, UK.