Blokiranje receptorjev za fage

UVOD

Eden izmed začetnih korakov pri okužbi z bakterijo je adsorpcija bakteriofaga na njeno površino. Bakteriofag mora biti sposoben prepoznavati množico različno zgrajenih gostiteljevih membran in celičnih sten, poleg tega pa se mora adsorbirati na površino kljub bakterijskih obrambnim mehanizmom. Mehanizme, ki preprečujejo adsorpcijo faga, lahko v grobem razdelimo v tri glavne skupine. Ena izmed njih je blokiranje fagnih receptorjev. Da bi bakterije omejile razmnoževanje faga, lahko prilagodijo strukturo svoje celične površine tako, da je adsorpcija bakteriofaga onemogočena.

ADSORPCIJA BAKTERIOFAGOV NA BAKTERIJO S. AUREUS

Eden izmed možnih načinov, s katerim poskuša bakterija Staphylococcus aureus preprečiti adsorpcijo faga, je sinteza specifičnega proteina, ki zakrije fagni receptor. To je protein A, ki so ga znanstveniki našli v celični steni S. aureus. Protein A ima 5 homolognih Ig-vezavnih domen (vsaka ima 3 α-vijačnice), s katerimi se lahko poveže s Fc-regijo IgG. Kot posledica interakcije med proteinom A in IgG nastane na površini bakterijske celice plast nepravilno orientiranih molekul imunoglobulina G, zaradi česar ti postanejo neprepoznavni za nevtrofilni Fc-receptor. Ko fag okuži bakterijo, ki ima normalno izražanje in delovanje proteina A, se fagocitoza kot posledica delovanja nevtrofilcev močno zmanjša. Bakterijski mutanti S. aureus nimajo delujočega proteina A, zato so dokazano v veliko večjem številu fagocitirani.

Da bi pokazali, ali ima protein A res vpliv na adsorpcijo bakteriofagov na S. aureus, so znanstveniki izvedli poskus, pri katerem so uporabili:

• 2 seva bakterije Staphylococcus aureus:
  • Cowan I (veliko proteina A) ter mutant Cowan I – NG 274 (zelo malo proteina A);
  • 8325 N (malo proteina A) ter mutant NG 11 (veliko proteina A);
• 3 stafilokokne bakteriofage: 52, 80 in 80α.

Bakterije so rasle na posebnem TSB-gojišču pri 37 °C. Nato so jim dodali suspenzijo fagov ter inkubirali. V odvisnosti od časa so merili delež adsorbiranih bakteriofagov na Cowan I, 8325 N ter njihovih mutantih (NG 274 in NG 11). Ugotovili so, da so mutanti Cowan I (z malo proteina A) adsorbirali 99,7 % bakteriofagov, Cowan I (z veliko proteina A) pa je adsorbiral le 23 % fagov. Podobno so ugotovili pri mutantih 8325 N (z veliko proteina A), katerih adsorpcija bakteriofagov je bila kar 100-krat manj učinkovita kot pri normalnih 8325 N (z malo proteina A). Torej protein A, ki se nahaja na celični površini, inhibira adsorpcijo fagov. Preverjali so tudi, kako lahko serinska proteaza tripsin vpliva na adsorpcijo fagov. Ko so bakterije seva Cowan I inkubirali v tripsinu, so ugotovili, da je proteaza razgradila protein A, kar je omogočilo adsopcijo fagov. Dlje kot so bakterije inkubirali v tripsinu, učinkovitejša je bila adsorpcija. Prav tako jih je zanimal vpliv prisotnega topnega in očiščenega proteina A na adsorpcijo fagov pri mutiranem sevu Cowan, ki nima proteina A na celični površini. Pokazali so, da koncentracija topnega proteina ne vpliva na zmanjšanje fagne adsorpcije, pač pa da je za inhibicijo vezave faga na receptor potreben protein A, ki mora biti prisoten na bakterijski površini.

Ker je celična stena grampozitivne bakterije S. aureus sestavljena iz O-acetilnih skupin na mukopeptidu, ki so odgovorne za adsorpcijo faga, hkrati pa je protein A kovalentno povezan s podenotami peptidoglikana, so znanstveniki povzeli, da protein A zakrije receptorje za fage in tako onemogoči adsorpcijo bakteriofagov.

ADSORPCIJA BAKTERIOFAGOV NA BAKTERIJE RODU BORDATELLA

Fazna variacija

Bakterije se morajo tako kot ostali organizmi ves čas prilagajati razmeram v okolju, saj bi drugače propadle. Na površini bakterijskih celic mora konstantno prihajati do sprememb v prisotnosti različnih proteinov in receptorjev, ki jim po eni strani omogočajo preživetje v določenem okolju, po drugi strani pa tudi pritrjanje na podlago in s tem kolonizacijo, izločanje toksinov ... Sposobnosti bakterij, da lahko spreminjajo celične komponente glede na pogoje v okolju preko regulacije izražanja genov, pravimo fazna variacija.

Lep primer fazne variacije lahko spremljamo pri gramnegativnih bakterijah (kokobacilih) iz rodu Bordatella, ki povzročajo bolezni respiratornega sistema. Pri tem rodu bakterij odziv na zunajcelične signale poteka prek dvokomponentnega regulatornega sistema BvgAS. Taki sistemi so v naravi zelo pogosti in služijo kot senzorji zunaj in znotrajceličnih dražljajev, ki jih nato prek delovanja senzorične histidin kinaze pretvorijo v znotrajcelični signal in odziv. BvgAS regulatorni sistem je sestavljen iz dveh proteinov, katerih zapisa se nahajata na lokusu bvg:

• BvgS je 134 kDa velika histidin kinaza, ki se nahaja v plazmalemi in je zgrajena iz medmembranske vhodne domene, domene PAS, transmiterske, sprejemniške ter C-končne domene, ki so med seboj povezane;
• BvgA je 23 kDa velik odzivni regulator, ki je v resnici DNA-vezavni transkripcijski faktor.

Pod vplivom spodbudnih signalov, ki prihajajo iz okolja in stimulirajo vhodno domeno, pride ob hidrolizi ATP do avtofosforilacije BvgS na konzerviranem histidinu na transmiterski domeni. Nastali fosfohistidin je zelo nestabilen, zato se fosfat prenese na aspartatni ostanek sprejemniške domene, od tu pa naprej na histidinski ostanek na C-končni domeni (govorimo o valuavtofosforilacij). C- končna domena v nadaljevanju prenese fosfatno skupino na protein BvgA in ga s tem aktivira, ta pa nato kot transkripcijski faktor deluje stimulativno na operonbvg ter na gene vag, med katere sodijo geni za virulentne faktorje, kot so adhezini, filamentni hemaglutinin (FHA), pertaktin in sekrecijski sistem tipa III in so nujno potrebni za kolonizacijo in infekcijo. Stanju, ko so virulenčni faktorji izraženi, pravimo Bvg+ faza, o Bvg- fazi pa govorimo, ko so aktivirani vrg geni (virulence-repressed genes), transkripcija vag genov pa je zavirana – torej se virulenčni faktorji ne izražajo in do kolonizacije ne more priti.

Ta fazna variacija bakterijam rodu Bordatella prinaša še eno (mogoče nenamerno, a zelo pomembno) prednost: ker se sestava površine celice zaradi prilagajanja okolju in kolonizacije ves čas spreminja, niso vsi proteini ves čas prisotni na površini celice, s čimer se bakterije nevede (vsaj delno) zaščitijo tudi pred bakteriofagi. Sprememba v konformaciji receptorjev ali pa neprisotnost določenih proteinov na površini celice v Bvg- fazi namreč onemogoči adsorpcijo virusov na površino celice. Kot primer takega načina obrambe lahko omenimo pertaktin – po funkciji adhezin ter avtotransporter, ki sodeluje pri vezavi na epitelijske celice, je pa obenem tudi primarni receptor za bakteriofag BPP-1. Slednji se na pertaktin veže z regijo Mtd, natančneje z njeno varianto Mtd-P1. En protomer trimernega Mtd-P1 se veže v veliko, drugi v malo zanko, tretji pa ostane prost. Ker se pertaktin izraža le v Bvg+ fazi, se lahko BPP-1 le v tej fazi veže na receptor, v Bvg- fazi pa bi bila v idealnih razmerah Bordatella pred bakteriofagom zaščitena. A evolucija virusov je zelo hitra, saj so mutacije genskega materiala zelo pogoste, zato so raziskave že pokazale, da tudi v Bvg- fazi pride do okužbe Bordatelle (sicer v milijonkrat manjši meri kot v Bvg+ fazi), kar pomeni, da je virus našel neko alternativno pot za vstop v celico, za katero prisotnost pertaktina ni potrebna.

Mutacije na genu mtd

Bakteriofag se prilagaja spremembam na površini gostiteljske celice tako, da uvaja mutacije na genu mtd. Te mu nato omogočajo, da se sintetizira modificirana oblika proteina Mtd, s pomočjo katerega se lahko veže na različne površinske receptorje bakterije v drugih fazah razvoja. V primeru, da se lahko adsorbira na bakterijo v fazi Bvg-, ga imenujemo fag BMP, če pa je vezava na površino neodvisna od faze, v kateri se bakterija nahaja, ga imenujemo fag BIP. Fagi lahko z različnimi frekvencami prehajajo med temi tremi oblikami (BPP, BMP in BIP).

Modifikacijo receptor vezavnega proteina bakteriofagu omogočata dve ponovitvi zaporedja DNA, ki kodirata C-končni del proteina Mtd. Prva ponovitev ima oznako TR (matrična ponovitev), druga pa VR (variabilna ponovitev). TR služi kot matrično zaporedje, ki se ne spreminja. S pomočjo mehanizma reverzne transkripcije prihaja do uvajanja mutacij na ponovitvi VR, ki se nato ob transkripciji in translaciji prenesejo na receptor vezavni protein Mtd. Ponovitev VR je sestavljena iz 134 baznih parov in se nahaja na 3'-koncu gena za protein Mtd. Navzdol od gena, ki kodira Mtd, najdemo ponovitev TR, ki je prav tako dolga 134 baznih parov in je v 90 % vseh baz identična VR. Do razlike v nukleotidih prihaja samo na mestih, kjer se v ponovitvi TR nahajajo adenozini, zato ta pojav imenujemo tudi A-mutageneza. Do substitucije adenozina z naključnim nukleotidom lahko pride na 23-ih različnih pozicijah, kar pomeni, da lahko teoretično nastane več kot 10^12 različnih polipeptidnih zaporedij. Poleg ponovitve TR se nahaja gen brt, ki kodira reverzno transkriptazo in ima pomembno vlogo pri nastanku sprememb na ponovitvi VR. Eden od štirih predlaganih mehanizmov uvajanja mutacij na zaporedju VR vključuje transkripcijo zaporedja TR, pri čemer nastane TR RNA. Reverzna transkriptaza nastalo molekulo RNA prepiše v enoverižno molekulo cDNA, pri tem pa se v nukleotidno zaporedje uvajajo nekomplementarne baze, ki ustrezajo položaju adenozinov na TR. Nastala molekula cDNA se preko parjenja baz poveže s ponovitvijo VR. Taki verigi zaradi sprememb v nukleotidih nista popolnoma komplementarni, zato povezovanju najverjetneje sledi replikacija, ki omogoči nastanek popolnoma komplementarnih verig.

ADSORPCIJA BAKTERIOFAGOV NA BAKTERIJI E. COLI IN P. AERUGINOSA

Do blokiranja receptorjev za fage prihaja tudi pri bakteriji Escherichia coli. Ko bakteriofag T5 okuži bakterijsko celico, E. coli sintetizira fag kodirajoči lipoprotein Lpl, ki se veže na fagni receptor FhuA in s tem prepreči, da bi se na receptorje že okužene celice vezali še drugi bakteriofagi (preprečena je naknadna okužba). Prav tako je s tem mehanizmom onemogočena vezava bakteriofagov na receptorje, ki se sprostijo iz liziranih celic.

Številni bakteriofagi okužijo bakterijo Pseudomonas aeruginosa preko pilusov tipa IV (T4P), ki torej predstavljajo fagne receptorje. T4P so sestavljeni iz več tisoč proteinov, imenovanih pilini, ki jih razdelimo v dve skupini: velike in male piline. Fagi se vežejo vzdolž celotnega pilusa, najverjetneje na velike piline. Vsak sev P. aeruginosa kodira enega od petih možnih tipov velikih pilinov, med katerimi sta dva tipa glikozilirana:

• pilin tipa I je glikoziliran na C-končnem serinskem ostanku,
• pilin tipa IV ima na večih serinskih in treoninskih ostankih pritrjen homopolimer D-arabinofuranoze.

Glikozilacija več tisoč izpostavljenih pilinov je energetsko zelo potraten proces, zato mora taka posttranslacijska modifikacija bakteriji prinašati določeno prednost. Oba sistema glikozilacije, ki ju najdemo pri bakteriji, predstavljata mehanizem, s katerim se bakterija zaščiti pred okužbo s fagom. Glikozilacija onemogoči bakteriofagom, da bi prepoznali vezavna mesta, in hkrati predstavlja sterično oviro. Seveda pa so se tekom evolucije razvili tudi bakteriofagi, ki so sposobni prepoznati glikozilirane receptorje in se kljub prisotnosti oligosaharidov adsorbirati na površino celice.

VIRI IN LITERATURA

• K. Nordström and A. Forsgren. Effect of protein A on adsorption of bacteriophages to Staphylococcus aureus. J. Virol., 1974, let. 14, št. 2, str. 198–202.
• Labrie, S. J. et. al. Bacteriophage resistance mechanisms. Nature Reviews Microbiology, 2010, let. 8, str. 317-327.
• Medhekar B. et. al. Diversity-generating retroelements. Current Opinion in Microbiology, 2007, let. 10, str. 388-395.
• Harvey, H. et. al. Pseudomonas aeruginosa defends against phages through type IV pilus glycosylation. Nature Microbiology, 2018, let. 3, str. 47-52.
• A. Bockand and R. Gross. The BvgAS two-component system of Bordetella spp.: a versatile modulator of virulence gene expression. Int. J. Med. Microbiol., 2001, let. 291, str. 119–130.