Priprava karboksipeptidaze iz glive Aspergillus niger M00988 za izboljšanje priprave oligopeptidov z visokim Fischerjevim razmerjem

Kronična obolenja, ki nastanejo kot posledica staranja in pogosto zaradi nezdravega življenjskega sloga, predstavljajo veliko težavo v zdravstvu po celem svetu. Z namenom preprečitve ali upočasnitve razvoja kroničnih bolezni zdravniki vse bolj spodbujajo k prehranjevanju s čim bolj pestrimi hranili (poleg rednega gibanja itd.). Med taka hranila sodijo tudi oligopeptidi z visokim Fischerjevim razmerjem. Fischerjevo razmerje je molarno razmerje med razvejanimi (valin, levcin, izolevcin) in aromatskimi aminokislinami (fenilalanin, tirozin). Oligopeptidi, ki imajo vrednost Fischerjevega razmerja vsaj 20, izboljšujejo jetrno funkcijo, kažejo nekatere antioksidativne lastnosti in uravnavajo strjevanje krvi [2]. Za pridobivanje takih oligopeptidov se zaenkrat uporabljajo encimske metode s peptidazami – ena izmed njih je tudi karboksipeptidaza.

Karboksipeptidaza

Karboksipeptidaze so eksopeptidaze, ki cepijo polipeptidno verigo na C-koncu. Najdemo jih v višjih rastlinah, glivah in živalskih tkivih. Glavni razlog za uporabo karboksipeptidaz za pripravo oligopeptidov s visokim Fischerjevim razmerjem je ta, da lahko odcepijo aromatske aminokisline s konca polipeptidne verige, s čimer se poviša Fischerjevo razmerje peptida (več razvejanih in manj aromatskih aminokislin) – na ta način cepi karboksipeptidaza A [1]. Pomembno je, da eksopeptidaza cepi dovolj specifično, saj v nasprotnem primeru ne dobimo oligopeptidov z želenim Fischerjevim razmerjem. V opisani študiji so raziskovalci preučevali karboksipeptidazo iz glive Aspergillus niger M00988. Z mutacijo treh aminokislin, ki se poleg drugih nahajajo v mestu za vezavo substrata, so želeli določiti vpliv velikosti aminokislinskega ostanka v vezavnem mestu za substrat na učinkovitost encima. S tem so želeli pridobiti encim, ki bolj specifično prepoznava in cepi aromatske aminokisline ter ga uporabiti za pripravo oligopeptidov z visokim Fischerjevim razmerjem [4].

Potek eksperimenta

Raziskovalci so gen za karboksipeptidazo (CPA) pridobili iz genoma glive Aspergillus niger s pomočjo verižne reakcije s polimerazo (PCR). Zapis so nato vstavili v plazmid pMD18-T in ga namnožili v celicah E. coli DH5α. Za izražanje so gen CPA vstavili v plazmid pCold-TF, s katerim so transformirali celice E. coli BL21. Izražanje so inducirali z dodatkom IPTG-ja, na novo pridobljeni encim pa so očistili s pomočjo nikelj-afinitetne kromatografije.

V več študijah je že bilo dokazano, da je specifičnost encima za določen substrat tesno povezana z mestom za vezavo substrata, ki se nahaja na encimu [3]. Če se vezavno mesto geometrijsko bolj prilega obliki substrata, se učinkovitost encima poveča – pri tem se nepolarna stranska veriga substrata ujame s hidrofobnim žepom encima, to pa predstavlja podlago za nastanek ugodnih interakcij med encimom in substratom. Raziskovalci so zato s pomočjo mestno-specifične mutageneze zamenjali aminokislinske ostanke, ki se nahajajo v vezavnem žepu za substrat. Pridobili so CPA mutante z mutacijami na mestih 125, 160 in 206: S135G, S135W, Y160G, Y160S, Y206G, Y206S. Njihovo učinkovitost so preverili s sintetičnimi peptidi, ki so predstavljali substrat. Za pridobitev oligopeptidov z visokim Fischerjevim razmerjem so uporabili algo Chlorella v prahu, ki je služila kot neke vrste substrat. Pri tem so v prvem koraku uporabili alkalno proteazo, ki večje proteine razcepi do peptidov, v naslednjem koraku pa karboksipeptidazo (ali njene mutante), ki je s peptidov odcepila aromatske aminokislinske ostanke [4].

Rezultati

Učinkovitost mutiranih variant encima so preverili z različnimi sintetičnimi peptidi. Mutanta, pri kateri je bil serin na 135. mestu zamenjan z glicinom, je bila bistveno bolj učinkovita kot tista, ki je bila zamenjana s triptofanom. Mutacije na mestih 160 in 206 so dale boljšo učinkovitost encima, če je bil tirozin zamenjan s serinom, medtem ko zamenjava z glicinom ni bila tako učinkovita. Pri pripravi oligopeptidov z visokim Fischerjevim razmerjem je bila najbolj uspešna mutacija Y160S – nastali so oligopeptidi s povprečnim Fischerjevim razmerjem 38,42, medtem kot je bila mutacija S135W najmanj uspešna – vrednost Fischerjevega razmerja je bila 26,77. Za primerjavo so v enem poskusu proteine tretirali samo z alkalno proteazo, ki je dala peptide s Fischerjevim razmerjem 12,95, ki pa je v primerjavi s hidrolizo v dveh korakih bistveno slabše [4].

Zaključek

Raziskovalci so v študiji s pomočjo mestno-specifične mutageneze spremenili karboksipeptidazo iz glive Aspergillus niger in na ta način izboljšali njeno aktivnost. Obenem so se mutirane različice encima izkazale kot učinkovite pri pripravi oligopeptidov z visokim Fischerjevim razmerjem. Raziskovalci so tudi pokazali, da je iz »surovih« in manj hranilnih proteinov (npr. iz praška Chlorella) možno pridobiti oligopeptide z visokim razmerjem med razvejanimi in aromatskimi aminokislinami, kar je lahko uporabimo v prehrambni industriji. Na podlagi rezultatov študije so možne tudi nadaljnje raziskave za preslikavo mehanizma na višjo skalo in s tem na industrijski nivo [4].

Viri

[1] Ambler, R. P. (1972). Carboxypeptidases A and B. Methods in Enzymology, 25(C), 262–272. https://doi.org/10.1016/S0076-6879(72)25023-6

[2] Fischer, J. E. (1990). Branched-Chain-Enriched Amino Acid Solutions in Patients with Liver Failure: An Early Example of Nutritional Pharmacology. Journal of Parenteral and Enteral Nutrition, 14(5_suppl), 249S-256S. https://doi.org/10.1177/014860719001400518

[3] Wang, S., Nie, Y., Xu, Y., Zhang, R., Ko, T. P., Huang, C. H., Chan, H. C., Guo, R. T., & Xiao, R. (2014). Unconserved substrate-binding sites direct the stereoselectivity of medium-chain alcohol dehydrogenase. Chemical Communications, 50(58), 7770–7772. https://doi.org/10.1039/c4cc01752h

[4] Xiong, K., Liu, J., Wang, X., Sun, B., Zhang, Y., Zhao, Z., Pei, P., & Li, X. (2021). Engineering a carboxypeptidase from Aspergillus niger M00988 by mutation to increase its ability in high Fischer ratio oligopeptide preparation. Journal of Biotechnology, 330, 1–8. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2021.02.015