Vloga gostiteljskih faktorjev pri replikaciji koronavirusne RNA

Uvod

Virusna patogeneza koronavirusov je odvisna od interakcij virusa z gostiteljsko celico. Translacija, modifikacija celičnih membran, replikacija in deregulacija celičnega cikla pri okužbi celice predstavljajo ključne procese pri raziskovanju interakcij virusa z gostiteljskimi celicami.

Gostiteljski faktorji pri vstopu koronavirusa v celico

Vstop koronavirusa v celico je ključen korak za začetek cikla replikacije. Ob vezavi virusa na gostiteljsko celico pride do fuzije virusne ovojnice s celično membrano gostiteljske celice. Za ta korak je najpomembnejši glikoprotein tipa I, to je S glikoprotein, sestavljen iz dveh podenot S1 in S2. Delujeta kot RBD (receptor-binding domain). Koronavirusi se med seboj razlikujejo po tem, ali se S protein med združitvijo oziroma med eksocitozo razreže ali ne. Pri večini alfa in beta koronavirusov se ne razreže, medtem ko se pri nekaterih beta in gama koronavirusov razreže na S1 in S2 domeni. To cepitev vrši furinska proteaza.

S protein spada v razred I fuzijskih proteinov, katerih struktura je precej karakteristična - oblika alfa-helikalnih vijačnic na C-terminalu. Ob fuziji virusne ovojnice in celične membrane pride do konformacijskih sprememb. Dve glavni sta: najprej nestrukturiran linker postane helikalni in omogoči tvorbo heliksov na N-terminalu, fuzijski protein se premakne proti gostiteljevi membrani in se vanjo zasidra, druga sprememba pa temelji na inverziji C-heliksa, ki se zareže v N-terminalne obvite vijačnice in tvori šest-helikalni snop. Tako se lahko zaradi bližine obe membrani povežeta.

Potencialna receptorja za vstop koronavirusa v celico sta ACE2 in DPP4. ACE2 (angiotezin konvertaza 2) je sestavljena iz dveh alfa-helikalnih struktur. Ključen je kanal na vrhu molekule, ki vsebuje aktivno mesto. Negativno nabita okolica kanala predstavlja vezavno mesto za pozitivno nabito RBD. DPP4 (dipeptil peptidaza 4) je dimer dveh identičnih podenot in ga najdemo na površini celic. Interagira s številnimi molekulami, inaktivira hormone, odigra pomembno vlogo pri signalizaciji in vnetnih odzivih. Afiniteta S proteina je večja do ACE2 kot do DPP4.

Translacija in UPR celic, okuženih s koronavirusom

Virusi temeljijo na translacijskem mehanizmu gostiteljske celice in sintezi njim lastnim proteinom, celica pa tudi sama sintetizira proteine kot imunski odziv na okužbo. Večina (+)RNA virusov zavre translacijo celične mRNA in favorizira sintezo viralnih proteinov. Pri evkariontih je ta pogojena z nastankom eIF2, s fosforilacijo njene alfa podenote s PKR pa je inhibirana translacija v gostiteljski celici. Replikacijski cikel koronavirusov je tesno povezan z endoplazemskim retikulumom, stres oziroma okužba celice pa se kaže kot pospešena transkripcija šaperonov. To povzroča S protein s svojo veliko molekulsko maso in glikozilacijo. Stres na ER sproži nerazvit odziv na beljakovine (UPR), ki inhibira fosforilacijo eIF2, stimulira zvijanje proteinov in sproži apoptozo.

Modifikacije gostiteljskih membran

Sinteza RNA poteka v citoplazmi in je povezana s strukturami, ki izvirajo iz celičnih endomembran. Enomembranske sferule, ki nastanejo z invaginacijo membranskih organelov in dvomembranski vezikli (DMV), ki so avtofagosomi, sta dve ključni membranski strukturi. Nekateri modeli predlagajo, da je koronavirus prevzel mehanizem avtofagije DMV-jev, spet drugo omenjajo EDEMosome, od katerih bi virus prevzel tvorbo membranskih struktur. Točno mehanizmi še niso znani.

Gostiteljski proteini interagirajo s koronavirusnim genomom in njegovo replikacijo ali izražanjem

Koronavirusni genom se zvije v RNA-strukture, v katere se vežejo virusni in celični proteini, ki delujejo kot stabilizatorji. Heterogeni ribonukleoprotein protein (hnRNP) 1 se veže na 5'-UTR v genomu virusa mišjega hepatitisa (MHV) in virus vnetja želodca in črevesja pri prašičih (TGEV). Akonitaza, stabilizirana s proteini toplotnega šoka, in nekateri hnRNP pa se vežejo na 3'-UTR in/ali na poli(A) rep. Nekateri RNA-vezavni proteini so pomembni samo za stabilizacijo strukture med replikacijo, drugi pa imajo dokazane provirusne vloge in sodelujejo pri premikih bralnih okvirjev (ORF).

Gostiteljski naravni imunski odgovori proti koronavirusom in virusni protiukrepi

Mnogi virusi, tudi (+)RNA virusi, so razvili različne mehanizme, s katerimi onemogočijo delovanje naravnega imunskega sistema. Celice naravnega imunskega sistema izražajo vzorčno prepoznavne receptorje (PRR), ki zaznavajo s patogeni povezane molekularne vzorce (PAMP). V primeru (+)RNA virusov so ti vzorci dvoverižna RNA (dsRNA) in 5'-fosfatne RNA, ki se pojavijo v citosolu med replikacijo. Celice naravnega imunskega sistema izražajo citosolne in endosomalne senzorje za prepoznavanje koronavirusov, med katere uvrščamo družino RIG-1 podobnih receptorjev (RLR; posebej RIG-I), z diferenciacijo melanome povezan protein 5 (MDA-5) in tolične receptorje (TLR; TLR2, TLR3, TLR4). MDA-5 je glavni citosolni senzor za prepoznavanje koronavirusnih RNA. Aktivirani PRR povzročijo izražanje interferonskih (IFN) regulatornih faktorjev (IRF) 3 in 7 ter NF-κB (iz angl. »kappa-light-chain-enchancer of activated B cells«). Ti povzročijo sproščanje IFN tipa 1 in provnetnih citokinov, ki aktivirajo kaskado z janusovo kinazo (JAK) ter signalnim prenašalcem in aktivatorjem transkripcije (STAT). Kompleksi proteinov vstopijo v jedro, kjer kot transkripcijski faktorji povzročijo izražanje protivirusnih z interferonom stimuliranih genov (ISG). Slednji sodelujejo pri vzpostavitvi protivirusnega stanja v okuženih celicah. Z mitogenom aktivirane protein kinaze so vključene v vzbujanje vnetnih citokinov interlevkinov (IL) 6 in 8 ter so pomembne za nasprotovanje koronavirusom. Povečano izražanje citokinov je povezano s težavnostjo bolezni covid-19. Pri SARS-CoV nestrukturni protein (Nsp) 1 zmanjšuje koncentracijo fosforiliranega STAT1 in tako blokira signaliziranje preko IFN. ORF6 fosforiliranemu STAT1 onemogoči vstop v jedro. Protein M virusov SARS-CoV in MERS-CoV posredno inhibira signaliziranje preko IRF3. ORF4b pri MERS-CoV kot fosfodiesteraza blokira naravni imunski odgovor, pri katerem sodeluje RNAza L.

S koronavirusi vzbujena deregulacija celičnega cikla

Koronavirusi po zgledu ostalih virusov v veliki meri vplivajo na celični cikel, tako da ga zaustavljajo v fazah, v katerih je fiziološko stanje določene celice donosno za določen tip koronavirusa. Nekaterim virusom, na primer ptičjemu koronavirusu (IBV), ustreza zaustavitev cikla v fazi S, torej v fazi podvojevanja DNA. Takrat nastane veliko faktorjev, ki sodelujejo pri replikaciji, virus pa jih lahko izkorišča lastne za potrebe. Koronavirusni Nsp15 inhibira tumor zavirujoči protein retinoblastoma (pRb), zato se poveča vstop celic v fazo S. Virus MHV po podobnem principu zaustavi cikel v fazi G1. Od ciklina odvisna kinaza 6 (CDK6) je pomembna za prehod iz faze G1 v S. To aktivnost izkorišča SARS-CoV, tako da prekomerno izraža protein N in s tem zavira CDK6 in nadaljevanje cikla v fazo S. Tumor zavirujoči protein p53 deluje protivirusno, zato mu koronavirusi nasprotujejo. Prvi mehanizem je uničenje p53 preko ubikvitinacije z ligazo RCHY1 po okužbi s SARS-CoV, pri čemer sodeluje Nsp3. Drugi mehanizem je preko deubikvitinacijske aktivnosti papainu podobne proteazne 2 domene.

Vloga ciklofilinov pri replikaciji koronavirusa

Ciklofilini so peptidil-prolil izomeraze (PPIaze), ki imajo številne fiziološke funkcije, med drugim tudi vlogo šaperonov in olajšanje zvijanja proteinov. Prav tako naj bi sodelovali v različnih signalnih poteh, pri apoptozi in spajanju RNA. Do zdaj je bilo identificiranih 17 ciklofilinov. Mnogi virusi pri svoji replikaciji potrebujejo ciklofiline. Le-ti, zlasti citosolni ciklofilin A (CypA) in na endoplazemski retikulum povezan ciklofilin B (CypB), predstavljajo ključne gostiteljske komponente, ki so vključene v replikativni cikel mnogih virusov (npr. ključen pomen pri preoblikovanju celičnih membran v organele pri replikaciji HCV, pomoč pri zorenju poliproteinov HCV, stabilizacija kapside HIV-1 in s tem zagotovljen vstop v jedro).

Raziskava, pri kateri so uporabili dvohibridni sistem kvasovke, je pokazala, da N-končna regija SARS-CoV proteina Nsp1 interagira s številnimi ciklofilini (CypA, CypB, CypG, CypH) in sorodnimi PPIazami. Znano je, da te molekule delujejo kot regulatorji poti NF-AT (jedrni faktor aktiviranih celic T), ki uravnava izražanje imunskih genov, ki kodirajo citokine (npr. IL-2).

Eden izmed možnih inhibitorjev ciklofilinov in agonistov poti NF-AT (posledično tudi inhibitorjev replikacije koronavirusov) je ciklosporin A (CsA). CsA je imunosupresiv, ki se veže na celične ciklofiline. Kompleks Cyp-CsA inhibira aktivnost kalcinevrina. To je vrsta fosfataze, katere aktivnost uravnata kalmodulin in kalcij. Kalcinevrin v limfocitih T z defosforilacijo aktivira transkripcijski faktor NF-AT. Inhibicija kalcinevrina torej blokira translokacijo faktorja NF-AT iz citosola v jedro in s tem prepreči transkripcijo imunskih genov, ki kodirajo citokine. Že nizke mikromolarne koncentracije inhibitorjev ciklofilinov (CsA ali Alisporivirja) zavirajo različne koronaviruse, vključno s SARS-CoV, HCoV, MHV in FCoV. Inhibicija replikacije koronavirusa z uporabo inhibitorjev ciklofilinov je torej pokazala pomembno vlogo le-teh pri replikaciji.

Pristopi in ugotovitve sistemske biologije

S kompleksnostjo interakcij med gostiteljem in virusom se ukvarja sistemska biologija. To je razmeroma mlado interdisciplinarno področje, katerega cilj je zagotoviti čim bolj realen in celosten vpogled v te interakcije z uporabo tehnik, kot so transkriptomika, metabolomika, proteomika in funkcionalna genomika. S pomočjo sistemske biologije so pri prepoznavanju gostiteljskih faktorjev pri replikaciji koronavirusne RNA prišli do naslednjih ugotovitev (opomba: le izbrane):

• Pri raziskavi okuženih subceličnih frakcij, obogatenih z Golgijem, so opazili, da so bili pri okužbi z MHV sekretorni proteini izčrpani, ribosomski pa obogateni. Izbitje siRNA treh izčrpanih proteinov (C11orf59, GLG1 in sec22b) je povečalo replikacijo virusa, medtem ko je povečano izražanje le-teh imelo nasproten učinek, kar kaže na pomembno vlogo sekretorne poti pri replikaciji virusa. Pomen te poti in kompleksa COPI je potrdila tudi proteomska analiza prečiščenih virionov SARS-CoV, pri kateri so poleg virusnih proteinov (nsp2, nsp3, nsp5), identificirali še 172 gostiteljskih proteinov v virionih.
• Številne kinaze gostiteljskih celic vplivajo na replikacijo SARS-CoV; 40 proteinov je »provirusnih«, ki spodbujajo učinkovito replikacijo, 90 (med njimi tudi CDK in PKR) pa jih deluje kot protivirusni dejavniki.

Viri

• A. H. de Wilde, E. J. Snijder, M. Kikkert, M. J. van Hemert: Host factors in coronavirus replication. In: Current Topics in Microbiology and Immunology. Springer Verlag 2018, Vol. 419, pp. 1–42.
• S. Belouzard, J. K. Millet, B. N. Licitra, G. R. Whittaker: Mechanisms of Coronavirus Cell Entry Mediated by the Viral Spike Protein. Viruses. Viruses 2012, pp. 1011–1033.
• K. Nakagawa, K. G. Lokugamage, S. Makino: Viral and Cellular mRNA Translation in Coronavirus-Infected Cells. In: Advances in Virus Research. Academic Press Inc. 2016, Vol. 96, pp. 165–192.
• M. Kikkert: Innate Immune Evasion by Human Respiratory RNA Viruses. Journal of Innate Immunity. S. Karger AG January 1, 2020, pp. 4–20.
• Y. Tanaka, Y. Sato, T. Sasaki: Suppression of Coronavirus Replication by Cyclophilin Inhibitors. Viruses. May 22, 2013, pp. 1250–1260.