Neodvisno uravnavanje jakosti in periode v sintetičnem oscilatorskem vezju preko modificiranega represilatorja

Izhodiščni članek: Zhang, F., Sun, Y., Zhang, Y. et al. Independent control of amplitude and period in a synthetic oscillator circuit with modified repressilator. Commun Biol 5, 23 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-021-02987-1

Uvod

Oscilatorska vezja so v naravi vsestransko prisotna. Genetski oscilatorji kot so p53 oscilator, NF-κB sunkovni oscilator, cirkadiani ritmi in mehanizem celičnega cikla so ključnega pomena v regulaciji procesov celic in večceličnih sistemov [1]. Značilnosti naravnih oscilatorjev so njihova stabilnost in sposobnost spreminjanja faze, periode in jakosti izhodnega signala. Sintetična vezja, ki se dan danes razvijajo strmijo k posnemanju le teh lastnosti in nakazujejo na možno praktično uporabo v pulznem dostavljanju zdravilnih učinkovin v medicini [2], [3]. Ustvarjanje minimaliziranih modularnih vodljivih oscilatorjev odpira možnosti njihove integracije v mnogo kompleksnejša vezja, kjer se lahko dinamično usklajuje končne produkte glede na željene rezultate [4].

Dva tipa oscilatorjev se izrazito preučujeta v poprej omenjene namene: dvojno povratni oscilator (DFO) in represilator (RLT). Prvi temelji na dveh povratnih zankah, npr. izražanje lacI (negativna povratna zanka) in araC (pozitivna povratna zanka). Stičišče teh dveh zank je promotor s pozitivno-negativno regulacijo, ki regulira izražanje obeh genov [5]. Po drugi strani represilator temelji na treh zaporednih represorskih genih, ki se vežejo na operatorske regije naslednjega gena v zaporedju. Prvi opisani represilator je bil Elowitzov represilator, ki je združil repressorje: TetR (Tn10 transpozon), LacI (laktozni opreon) in cI (bakteriofag λ)[3]. V nasprotju z DFO so vodljivi RLT ostajali predmet teoretičnih modelov [6].

Ideja raziskovalne skupine je bila zasnovati represilatorsko vezje, ki se poslužuje dveh induktorjev: enega, ki spreminja periodo izhodnega signala in drugega, ki omogoča reguliranje jakosti signala. Prvi naj bi deloval neposredno na osrednje oscilatorski vezje, medtem ko bi drugega vključili v vezje preko uporabe promotorja z »dvojnim vnosom« (s pozitivno-negativno regulacijo). Spremljanje izhodnega signala reporterskega dela vezja so izvajali s pomočjo mikrofluidnidnega sistema. V nadaljevanju so razvili še kvantitativni model za napovedovanje odziva glede na dodane koncentracije induktorjev. Delo je praktična nadgradnja teoretičnih osnov, ki so jih začrtali Tomazou et al [6].

Rezultati

Genetsko vezje

Izhajali so iz plazmidov pLPT119 in pLPT41. pLPT119 je bil plazmid z že vstavljenim vezjem za izvedenko Elowitzovega represilatorja z reporterskim genom mVenus(zapis za rumen fluorescenčen protein –YFP) pod regulacijo promotorja P(LTetO-1). Srž dela je bila uvedba vozlišča, ki bi povezoval regulacijo amplitude in faze s končnim izhodnim signalom. Zato so se odločili nadomestiti obstoječ promotor P(LTetO-1) z de novo sestavljenim promotorjem z »dvojnim vnosom«. V osnovi je šlo za promotor P(ECF11), ki ga aktivira σECF11. Preko saturacijske mutageneze so promotorju določali jederne promotorske regije. Izkazalo se je, da so le te dovolj izolirane, da mutacije izven regij ne vplivajo na funkcijo celotnega promotorja. Tako so lahko v bližino jedrnih regij promotorjev dodali vezavno mesto za TetR. Pridobljeni promotor P(DUAL) so vstavili pred mVenus z metodo sestavljanja po Gibsonu [3], [7].

Drug plazmid je vseboval vezje, ki je nadzorovalo izražanje σECF11. S sistemom NahR-PSal so dosegli, da se je konstitutivno izražal protein NahR, ki je zaviral izražanje σECF11. Ob dodatku salicilne kisline (I1) pa se je negativna regulacija σECF11 zmanjšala in induciral se je lahko mVenus. Sklepali so, da se bo z večanjem koncentracije salicilne kisline večala amplituda izhodnega signala.

Za induktor, ki bi nadzoroval periodo, so si izbrali IPTG (I1). Ker zavira represijo z LacI, bi na samo represilatorsko vezje vplival tako, da bi podaljšal čas preklapljanja med posameznimi represorji [3].

Spremljanje sistema

Oscilacije na celični ravni so spremljali preko mikrofluidnega sistema. Sestavljen je bil iz 8 glavnih kanalov za polnjenje in dovajanje gojišča. Vsak kanal je imel po 120 stranskih kanalčkov, v katere so s centrifugiranjem vstavili transformirane celice E. coli K-12 DH10B. Ob konstantnem pretoku 40 µl/h so spremljali fluorescenco posameznih kanalčkov pod fluorescenčnim mikroskopom [3].

Umerjanje in karakterizacija sistema

V začetku so delovanje vezja preverili s testi prižiga in vklopa regulacije amplitude in periode. Ob neprisotnosti IPTG so spremljali spreminjanje fluorescence v odvisnosti od časa za koncentracije salicilne kisline 0 µM in 200 µM. Povprečna intenziteta vrhov je bila pri odsotnosti salicilne kisline le 17,9 a.u., medtem ko je ob dodatku narasla vse do 2963 a.u., kar je potrdilo delovanje vezja za regulacijo amplitude. Podobno so preverili delovanje regulacije periode z koncentracijama IPTG: 0 µM in 10 µM. Izkazalo se je, da se je število vrhov v poskusu zmanjšalo za 1, kar je nakazovalo, da je dodatek IPTG povzročil podaljšanje periode oscilacije [3]. V nadaljevanju so izvajali poizkuse z variacijo kombiniranih koncentracij obeh induktorjev. To so storili v obliki matrike 4x4, kjer so imeli gradient štirih koncentracij IPTG: 0 µM, 2,5 µM, 5 µM in 10 µM ter gradient salicilne kisline: 0 µM, 50 µM, 100 µM, 200 µM. Dobljeni rezultati so bili podobni tistim, ki so jih pridobili s testi vklopa in izklopa vezja. Pri konstantnih koncentracijah IPTG se je ob višanju salicilne kisline višala amplituda, pri enakih koncentracijah salicilne kisline in različnih koncentracijah IPTG pa se je večala perioda oscilacij [3].

Opazili so tudi, da ima vezje fizične omejitve. Nad 200 µM salicilne kisline in 10 µM IPTG se amplituda vezja in perioda nista več spreminjali. Domnevali so, da je bil razlog zasičenje z induktorji. Iz zbranih podatkov so zaključili, da lahko amplitudo vezja spreminjajo med 48,0 ± 9,4 a.u. in variirajo periodo med 323,9 ±1,9 min [3].

Kvantitativni model

Delovanje vezja so nato želeli kvantitativno opisati z modelom, ki bi lahko iz izhodiščnih parametrov napovedal odstopanja v oscilaciji. Model so razdelili na tri komponente: regulacija periode, regulacija amplitude in izhodni signal [3].

Najprej so definirali diferencialne enačbe, ki so opisovale translacijo proteinov vezja. Ločevali so med zvitimi in nezvitimi proteini. Spremembo koncentracije danega nezvitega proteina v kratkem časovnem intervalu so opisali kot produkt koncentracije prisotne mRNA in faktorja hitrosti translacije. Produktu so odšteli zmnožek konstante zvitja in koncentracije nezvitih proteinov (proteini, ki se zvijejo), in odšteli še izgube zaradi razredčitve proteinov med delitvijo celic (faktor razredčitve pomnožen s koncentracijo nezvitih proteinov). Podobno so naredili tudi za zvit protein, le da so celotni pozitivni prispevek predstavljali proteini, pridobljeni z zvitjem (člen, ki smo ga prej odšteli) in od tega je bil odštet zmnožek faktorja razredčitve ter koncentracije zvitih proteinov [3], [6].

Temu je sledil opis diferencialnih enačb za transkripcijo. Vključevale so spremenljivke: število kopij genov, konstanto bazalne hitrosti transkripcije, konstanto največje hitrosti transkripcije, značajno koncentracijo, ki opisuje količino potrebnega represorja za polovično maksimalne stopnje represije in stopnjo razpadanja mRNA [3], [6].

Efekt induktorja IPTG so vključili v diferencialno enačbo koncentracijo prepisane mRNA za TetR, saj ga je neposredno nadzorovala inhibicija LacI z IPTG. Efekt salicilne kisline so vključili enačbo od koncentracije prepisane mRNA za σECF11. Končna diferencialna enačba je opisovala spremembo koncentracije mRNA reporterskega proteina mVenus v majhnem časovnem intervalu. V tej enačbi so se poleg poprej omenjenih vpeljale še koncentracije TetR in σECF11. Preko iterativnega računanja ekspresije na podlagi vseh omenjenih enačb so lahko simulirali osciliranje fluorescence v modelu [3].

Napovedno moč modela so ocenili z računanjem korena povprečne kvadratne napake (RMSE) iz modelnih in eksperimentalno določenih podatkov. RMSE za amplitudo signala je znašal 97,0 a.u., RMSE za periodo pa 4, 3 minute. Iz tega so sklepali, da je model sprejemljiv [3].

Zanimala jih je tudi ortogonalnost modela in eksperimentalnega vezja. To so preverili z računanjem skupne informacije (angl. mutual information) za vsak par izhodnih informacij (amplituda, perioda) in vhodnih signalov (I1, I2). Tudi tu se je pokazalo, da sta tako model kot eksperiment primerno ortogonalna [3].

Zaključek

Zasnova vodljivega represilatorskega vezja je temeljila na principih: izbire robustnega vezja, reduciranja števila komponent vezja, izbire komponent, ki omogočajo kvantifikacijo vezja in končno poenostavljenja delovanja vezja brez izgube funkcije. Slednji princip je bil uporabljen pri izbiri reporterskega gena pod kontrolo promotorja z dvojim vnosom, saj se je s tem zaobšlo oviro nadzorovanja amplitude na represilatorskem delu. Zagotovljena je bila tudi ortogonalnost učinkov obeh induktorjev [3].

Razvoj kvantitativnega modela omogoča modularno uporabo RLT. Modularen RLT bi sprejemal dva vhodna signala in imel en izhodni oscilatorski signal, ki pa ga ne smemo razumeti kot končni cilj uporabe modularnega vezja. Prav nasprotno bi lahko z analizo amplitude in periode izhodnega signala izračunali vrednosti vhodnih signalov in s tem lahko spremljali informacije o delovanju večjih biološko sinteznih naprav, v katere bi vključili modularen RLT [3], [6].

Med druge možne načine uporabe novega vezja sodijo pulzni dostavljalni sistemi za zdravila. Potreba po razvoju teh sistemov je velika, saj v telesu pogosto konstantno sproščanje zdravilnih učinkovin nima vseh zaželenih efektov. Velikokrat so že obstoječi pulzni sistemi omejeni s časom trajanja oz. časom oddajanja učinkovin, ki sicer ne bi bili problem z opisanimi sintezno biološkimi pristopi [3], [8].

Viri:

[1] Z. Li in Q. Yang, „Systems and synthetic biology approaches in understanding biological oscillators“, Quant Biol, let. 6, št. 1, str. 1–14, mar. 2018, doi: 10.1007/s40484-017-0120-7.

[2] D. Jain, R. Raturi, V. Jain, P. Bansal, in R. Singh, „Recent technologies in pulsatile drug delivery systems“, Biomatter, let. 1, št. 1, str. 57–65, jul. 2011, doi: 10.4161/biom.1.1.17717.

[3] F. Zhang idr., „Independent control of amplitude and period in a synthetic oscillator circuit with modified repressilator“, Commun Biol, let. 5, št. 1, Art. št. 1, jan. 2022, doi: 10.1038/s42003-021-02987-1.

[4] E. J. Olson, L. A. Hartsough, B. P. Landry, R. Shroff, in J. J. Tabor, „Characterizing bacterial gene circuit dynamics with optically programmed gene expression signals“, Nat Methods, let. 11, št. 4, str. 449–455, apr. 2014, doi: 10.1038/nmeth.2884.

[5] Y. J. Joshi, Y. K. Jawale, in C. A. Athale, „Modeling the tunability of the dual-feedback genetic oscillator“, Phys Rev E, let. 101, št. 1–1, str. 012417, jan. 2020, doi: 10.1103/PhysRevE.101.012417.

[6] M. Tomazou, M. Barahona, K. M. Polizzi, in G.-B. Stan, „Computational Re-design of Synthetic Genetic Oscillators for Independent Amplitude and Frequency Modulation“, Cell Syst, let. 6, št. 4, str. 508-520.e5, apr. 2018, doi: 10.1016/j.cels.2018.03.013.

[7] Y. Zong idr., „Insulated transcriptional elements enable precise design of genetic circuits“, Nat Commun, let. 8, št. 1, Art. št. 1, jul. 2017, doi: 10.1038/s41467-017-00063-z.

[8] V. N. L. Sirisha, M. Namrata, in B. Sruthi, „Pulsatile Drug Delivery System-A Review“, str. 11.