Biogeneza in delovanje spliceosomske komponente U1

Uvod

Pri translaciji genetske informacije se mora RNA ustrezno modificirati. Zato mora biti prekurzorska sporočevalna RNA (pre-mRNA) deležna splicinga oz. spajanja eksonov. Splicing nadzira spliceosom, dinamičen ribonukleoproteinski kompleks sestavljen iz malih jedrnih RNA (snRNA) in vezanih proteinov. Prepozna ustrezna mesta med introni in eksoni, ki so običajno GU dinukleotidi na 5' koncih intronov in AG dinukleotidi na 3' koncih intronov. Človeški spliceosom je sestavljen iz petih majhnih ribonukleoproteinskih kompleksov: U1, U2, U4, U5 in U6. Ti se stopenjsko sestavijo na pre-mRNA. Slika 1A iz članka prikazuje sistem sestavljanja spliceosoma po intronskem modelu, kjer se snRNP kompleksi povezujejo čez introne. V transkriptih z dolgimi introni in kratkimi eksoni pa se spliceosom običajno sestavi po eksonskem modelu, kjer pride do vezave čez ekson. Tekom sestave spliceosoma 5‘ cepitveno mesto tvori intronski lariat, ki se sprosti s cepitvijo na 3’ cepitvenem mestu in eksoni se povežejo. Ti lariati niso nujno popolnoma razgrajeni temveč se lahko modificirajo v funkcionalno nekodirajočo RNA (ncRNA). To sta lahko majhna nukleolarna RNA (snoRNA) in mikro RNA (miRNA), ki imata regulatorno vlogo pri modifikacijah RNA in ekspresiji genov. U1 snRNP kompleks je med kompleksi spliceosoma najbolj številčen (1 milijon kopij na celico), ker je ključen za iniciacijo izrezovanja intronov in inhibicijo cepitve 3' konca ter poliadenilacije pre-mRNA. Njegova disfunkcija je bila povezana z rakom, nevrodegeneracijo in starostnimi boleznimi, kar poudarja njen biološki in klinični pomen[1].

U1 snRNP kompleks

U1 snRNP kompleks iniciira sestavo spliceosoma, tako da prepozna in se veže na cepitvena mesta na pre-mRNA. Ta vezava omogoči naknadno vezavo ostalih snRNP-jev. Interakcije protein-protein med snRNP-ji olajšajo sestavo celotnega spliceosoma. U1 snRNP je sestavljen iz U1 snRNA, Sm heptamera in treh specifičnih proteinov U1-70K, ki ga kodira SNRNP70 gen, U1-A, ki ga kodira SNRPA gen, in U1-C, ki ga kodira SNRPC gen (slika 1B iz članka). Sm heptamer je vezan na Sm vezavno mesto na snRNA. Gre za heptamer proteinov, ki so pomembni za stabilizacijo U1 snRNA, sestavljanje U1 snRNP kompleksa in prepoznavo 5' cepitvenega mesta na pre-mRNA pri splicingu. Prisotnost vseh teh komponent omogoča natančno prepoznavo cepitvenih mest [1][2].

Vezava samega U1 snRNP kompleksa na 5' cepitvenih mestih v novo prepisanih intronih ima pomembno vlogo pri transkripciji, ker aktivno povečuje elongacijsko hitrost RNA polimeraze II. To zmanjša možnosti, da RNA polimeraza II naleti na ovire kot so poliadenilacijska mesta (PAS) in transkripcijska zaustavitev. Tako se zagotovi popolna transkripcija dolgih genov. Pri tem ima U1-70K ključno vlogo, ker interagira neposredno s CPSF in se tako vmeša v cepitev in sestavo poliadenilacijskega kompleksa. Inhibicija prekurzorske poliadenilacije in omogočenje celotne transkripcije, zaradi elongacije le te z navzgornjimi promotorji daje U1 snRNP kompleksu dodatno vlogo promocije dostopnosti kromatina in ojačitve serin 5 fosforilacije RNA polimeraz II pri navzdoljnih promotorjih, kar vodi do njihove aktivacije.

Še ena kotranskripcijska regulatorna vloga U1 snRNP kompleksa je telescripting. Gre za utišanje prekurzorskega cepljenja na 3' koncu in poliadenilcije v transkriptih RNA polimeraze II, kar je pomembno za celotno transkripcijo tisočerih kodirajočih mRNA in dolgih nekodirajočih RNA (lncRNA) [3].

Kadar pride do prepisa transkriptov, ki vsebujejo intronske PAS, morajo biti le ti razgrajeni s strani RNA eksosomov, da se prepreči sinteza skrajšanih in nefunkcionalnih proteinov. Takšni transkripti vsebujejo kombinacijo 5' cepitvenega mesta in poli(A) stika. Ta kombinacija se imenuje jedrni RNA degradacijski kod (NRDC), ki ni prisoten pri pravilno procesiranih RNA, saj sproži njihovo razgradnjo. U1 snRNP kompleks skupaj s cepitvenimi in polidaenilacijskimi faktorji se veže na NRDC in kooperativno rekrutira PAXT (angl. Poly(A) tail exosome targeting) adaptor, ki omogoča vezavo RNA eksosoma in razgradnjo pokvarjenih RNA.

U1 snRNP kompleks ima tako pomembno vlogo v kontroli kvalitete transkriptoma, zaradi njegovih vlog pri razgradnji RNA, transkripcijski elongaciji in telescriptingu [1].

Biogeneza U1 snRNP

Začetek sinteze je v jedru, kjer se gen RNU1-1 prepiše v pre-U1 snRNA, ki ima poleg osnovnega RNA ogrodja U1 komponente še 50 nukleotidov na 3' koncu. V Cajalovem telescu se nato sestavi eksportni kompleks, saj se mora pre-U1 snRNA prenesti v citosol za uspešno dodajanje Sm jedra, ki je ključni del funkcionalnega U1 snRNP. Eksportni kompleks se na takšno RNA veže s prepoznavo 7-metilgvanozinske kape (m7G kapa).

V citoplazmi eksportni kompleks ob vezavi U1-70K razpade in se s pomočjo SMN kompleksa, katerega ključni del je SMN (angl. survival motor neuron protein) doda Sm jedro. Pravilno sestavljeno Sm jedro prepozna eksonukleaza TOE1, ki odcepi končnih 50 nukleotidov na 3' koncu. Ta korak služi kot "kontrola kvalitete", saj lahko le do te točke pravilno sestavljeni snRNP nadaljujejo pot v procesu. Sledi hipermetilacija m7G kape v 2,2,7-trimetilgvanozinsko kapo (TMG kapo), ki poteče s pomočjo PRIP-interagirajočega proteina, ki ima metiltransferazno domeno.

Sm jedro in TMG kapa predstavljata jedrni lokalizacijski signal, na katerega se lahko veže jedrni importni kompleks, ki celotno snRNP prenese nazaj v jedro. Le-ta v jedru razpade, da se lahko na snRNP vežejo še U1-specifični proteini, kot sta U1-A in U1-C, ter potečejo še končne post-translacijske modifikacije. Tako je U1 snRNP pripravljena, da se z drugimi komponentami veže v spliceosom.

povezava do slike, ki opisuje proces (stran 4 v članku)

Določanje izrezovalnega mesta na daljavo

Glavni vzrok za bolezni kot so spinalna mišična atrofija (SMA), hemofilija B, cistična fibroza, fenilketonurija itd. je nepravilno izrezovanje intronov, kar posledično vodi do okrnjenih in nefunkcionalnih proteinov. Specifično pri teh boleznih prihaja do preskakovanja eksonov, ki v zrelo mRNA tako niso vključeni.

Spinalna mišična atrofija (SMA) in U1 snRNP

Človek ima v svojem genomu dva gena (SMN1 in SMN2) za protein SMN, ki sta nastala s podvajanjem in sta si torej dokaj podobna. Pri bolezni SMA pride do okvare gena SMN1, zato ne nastane funkcionalen protein SMN, ki je odgovoren za transkripcijo, translacijo, biogenezo U1 snRNP, RNA razmeščanje ... Odgovornost za slednji dve funkciji je glavni razlog za nastanek SMA. Ker je v genu SMN2 prisotna kritična mutacija, ki povzroči preskakovanje eksona 7 pri izrezovanju intronov, le-ta ne more nadomestiti gena SMN1, ko je le-ta okvarjen. Pri večini pacientov s SMA so namreč našli funkcionalen gen SMN2.

V raziskavah je bilo potrjeno, da lahko pravilno izrezovanje intronov in vključitev eksona 7 v zrelo mRNA izboljša uporaba umetnih eU1 (angl. engineered U1 snRNP), katerih 5' konci se zelo dobro prilegajo tarčnemu vezavnemu mestu na pre-mRNA. Zanimivo je, da se takšni eU1 ne vežejo nujno samo na 5' mesto izrezovanja (angl. 5' splice-site - 5'ss), ampak tudi navzgor in navzdol od tega mesta (v nekaterih primerih tudi do 100 nukleotidov stran). To pomeni, da je eU1 lahko definirala spoj med eksonom in intronom na daljavo. Pri takih primerih očitno ne velja več klasična definicija eksona na podlagi tega, da se U1 veže na 5'ss, U2 pa na 3'ss (definicija 3'ss analogna 5'ss). Torej moramo za razlaganje takšnega dogajanja uporabiti drugačno definicijo eksona – model določanja izrezovalnega mesta na daljavo.

Delovanje apoptoze na U1 snRNP kompleks

Med apoptozo se U1 snRNP spremeni zaradi delovanja kaspaz in drugih proteazm kar povzroči do cepitve U1 kompleksa in njegove funkcionalne inaktivacije. Te spremembe prispevajo k zaustavitvi transkripcije in procesiranja RNA, ter spodbujajo potek celične smrti Specifična cepitev proteina U1-70K je značilen biokemični znak apoptoze, zato se cepitev U1-70K pogosto uporablja kot marker apoptoze. Protein U1-70K cepi kaspaza-3 na mestu D341, kar vodi do nastanka N-terminalnega fragmenta velikosti 40 kDa in C-terminalnega fragmenta velikosti 22 kDa. Dokazano je bilo, da se U1-70K cepi, medtem ko je še vedno del nespremenjenega kompleksa U1 snRNP, pri cepitvi 40 kDa fragment ostane povezan s kompleksom. Med apoptozo se avtoantigeni kopičijo v dveh populacijah membranskih izboklin (blebov) na površini celice. U1-70K je zgodaj lokaliziran v jedru, kasneje pa se njegovi epitopi kopičijo v apoptotskih telescah. Pri različnih oblikah celične smrti se U1-70K obnaša različno, na primer pri nekrozi se razgradi v nedoločljive fragmenta. Pri CTL-inducirani (citoksični limfocit T)apoptozi granzim B cepi kompleks v 60kDa fragment, pri oksidativnih procesih pa se lahko razgradi v fragmente velike 33-38 kDa. Apoptoza aktivira kaspaze, ki cepijo Sm-F blizu C-konca, ta cepitev destabilizira strukturo splicesoma. Nastane 9 kDa velik fragmenta, ki ostane povezan z U snRNP kompleksi. Spliceosomski Sm proteini so tarča anti-Sm avtoprotiteles, ki se pojavljajo izključno pri bolnikih s sistemskim lupusom eritematozusom (SLE). Zato se ta protitelesa uporabljajo kot diagnostični markerji.

Imunski odziv proti U1 snRNP

Dokazano je bilo, da se avtoprotitelesa proti komponentam U1 snRNP pojavljajo v značilnem zaporedju, pri čemer sta U1-70K in Sm-B/B′ zgodnja imunogena. Analiza pri bolnikih je pokazala, da se protitelesa proti U1-70K in Sm-B/B′ pojavijo prej kot proti drugim komponentam, medtem ko se protitelesa proti U1A, U1C in Sm-D pojavijo kasneje. To skupaj z dejstvom, da se U1-70K med apoptozo modificira, podpira hipotezo, da so apoptotske spremembe U1-70K ključne za sprožitev imunskega odziva proti kompleksu U1 snRNP. U1 snRNA neposredno prispeva k aktivaciji imunskega sistema z interakcijo z endosomskimi Tollu podobnimi receptorji (TLR), zlasti TLR7 in TLR8. Med celično smrtjo se kompleks U1 snRNP, ki vsebuje U1 snRNA, premakne iz jedra v citoplazmo. Po izhodu iz jedra se kompleks U1 snRNP premakne na apoptotska telesca, kjer postane dostopen avtoprotitelesom. Ta avtoprotitelesa omogočijo nastanek imunskih kompleksov, ki jih nato prevzamejo imunske celice, kar omogoči da pride do aktivacije TLR-odvisnih signalnih poti. U1 snRNA ima dvoverižno sekundarno strukturo, zaradi katere lahko deluje kot ligand za TLR receptorje in sproži prirojeni imunski odziv, vendar mora biti prisotna v endosomih. Ko vstopi v endosom, kot del snRNP kompleksa ali kot del imunskega kompleksa vezanega na avtoprotitelesa, neposredno aktivira TLR7 in TLR8, kar vodi do močne produkcije pro-vnetnih citokinov, kot je interlevkin-1β. Ti povečajo vnetje (aktivacijo drugih imunskih celic), zvišanjo telesno temperaturo in spodbujanjo izražanje drugih vnetnih molekul.

Viri

1. Soares, E. S., Leal, C. B. Q. S., Sinatti, V. V. C., Bottós, R. M., & Zimmer, C. G. M. (2025). Role of the U1 snRNP Complex in Human Health and Disease. Wiley interdisciplinary reviews. RNA, 16(4), e70026. https://doi.org/10.1002/wrna.70026
2. So, B. R., Wan, L., Zhang, Z., Li, P., Babiash, E., Duan, J., Younis, I., Dreyfuss, G. (2016). A U1 snRNP-Specific Assembly Pathway Reveals the SMN Complex as a Versatile RNP Exchange. Nature Structural & Molecular Biology. 23(3):225–230.
https://doi.org/10.1038/nsmb.3167
3. Di, C., So, B. R., Cai, Z., Arai, C., Duan, J., Dreyfuss, G. (2019). U1 snRNP Telescripting Roles in Transcription and Its Mechanism. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 84:115-122. https://doi.org/10.1101/sqb.2019.84.040451
4. Singh, R. N., & Singh, N. N. (2019). A novel role of U1 snRNP: Splice site selection from a distance. Biochimica et biophysica acta. Gene regulatory mechanisms, 1862(6), 634–642. https://doi.org/10.1016/j.bbagrm.2019.04.004
5. Lorson, C. L., Rindt, H., & Shababi, M. (2010). Spinal muscular atrophy: mechanisms and therapeutic strategies. Human molecular genetics, 19(R1), R111–R118.
https://doi.org/10.1093/hmg/ddq147