Optimizacija signalnih peptidov težkih in lahkih verig za večjo ekspresijo terapevtskih protiteles v CHO celičnih linijah

UVOD

Rekombinantna monoklonska protitelesa, pridobljena iz celičnih linij CHO, predstavljajo najhitreje rastoči razred bioterapevtikov, zato so se v tej raziskavi usmerili na izboljšanje zaporedja signalnih peptidov humanih imunoglobulinskih težkih in lahkih verig protiteles, ki doprinese k večji produkciji in sekreciji protiteles. Izbrane signalne peptide so preizkusili na petih najbolje prodajanih terapevtikih, in sicer Humira (adalimumab), Remicade (infliximab), Avastin (bevacizumab), Rituxan (rituximab) in Hepceptin (transtuzumab). Ključen korak v proteinski sekreciji je translokacija iz citosola v ER, ki je uravnavana s signalnim peptidom, ki vsebuje med 5 in 30 aminokislin in se nahaja na N-terminalnem koncu nastajajočega proteina. Študije so pokazale, da so omenjeni signalni peptidi zelo heterogeni in celo izmenljivi med različnimi vrstami organizmov. Svojo pomembnost pa so dokazali tudi pri proteinski sekreciji, in sicer učinkovitost je močno odvisna od njihovega zaporedja. Tako kot mnogi drugi proteini, se tudi protitelesa izločajo iz celic po kotranslacijski translokacijski poti. N-terminalno zaporedje nastajajočega proteina prepozna SRP (signal recognition particle), ki SRP-RNC kompleks proteina in ribosoma dostavi do SRP receptorjev na membrani ER. V lumen ER vstopa nastajajoča polipeptidna veriga, SPP (signal peptide peptidase) pa delo dokonča in odcepi stran signalni peptid. To cepljenje vpliva na samo učinkovitost izločanja rekombinantnih protiteles iz sesalskih celičnih sistemov, zato so želeli v tej študiji na podlagi boljših signalnih zaporedij izboljšati količino protiteles.

MATERIALI IN METODE

Z ustvarjanjem podatkovne baze humanih signalnih peptidov za težke in lahke kappa verige so le-te lahko pregledno uvrstili in jih razvrstili glede na podobnosti v sekvenci. Nadaljevali so z generiranjem konstruktov za težke in lahke kappa verige in iskanjem variabilnih regij izbranih verig iz javno dostopnih podatkovnih baz. Analizirali so signalne peptide iz 172 težkih verig IgG, IgM, IgD, IgA in IgE, ter iz 62 lahkih verig. Identificirali so najboljših osem signalnih peptidov za težke verige (H1 do H8) ter dva za lahke (L1 in L2) in izvedli njihovo fuzijo s konstantnimi regijami IgG1 z metodo prekrivajočega se PCR. Vsako težko in lahko verigo terapevtskih protiteles so fuzirali z vsemi izbranimi signalnimi peptidi za obe verigi. Izvedli so transfekcijo na CHO-K1 celicah z uporabo FuGENE 6 reagenta. Sledila je analiza uspešnosti transfekcije z imunoadsorpcijskim testom ELISA. Z uporabo kita za mestno specifične mutacije so ustvarili mutante signalnega peptida H7 za Avastin. Protitelesa so bila očiščena s FPLC, z masnim spektrometrom pa so preverjali dejansko vgradnjo signalnih peptidov v variabilne dele lahkih in težkih verig.

REZULTATI

Večina signalnih peptidov težkih verig vsebuje 19 aminokislin, ki jih lahko razvrstimo med tri domene, vse signalne peptide obravnavanih lahkih verig pa sestavlja 22 aminokislin. S šestnajstimi narejenimi kombinacijami med lahkimi in težkimi verigami so testirali njihov vpliv na izločanje protiteles in ugotovili, da najboljše rezultate v smislu najvišje sekrecije prispeva signalni peptid H7 pri terapevtikih Avastin, Remicade, Rituxan in Humira z obema možnima kombinacijama signalih peptidov lahkih verig (L1 in L2). Za najboljše kombinacije signalnih peptidov za obe verigi so se izkazali pari H5/L1, H7/L1, H7/L2, H7/L2 in H7/L1. Največje izločanje protiteles iz celic se je pokazalo v naslednjem vrstnem redu: Herceptin > Rituxan > Avastin > Humira > Remicade. V primeru Rituxana so dokazali znantno boljše sekrecijske sposobnosti z optimiziranimi signalnimi peptidi (H7/L2) v primerjavi z nativnimi.

ZAKLJUČEK

V raziskavi so uspeli optimizirati pare signalnih peptidov za variabilne regije obeh verig petih najbolje prodajanih terapevtskih mAb in s tem povečati njihovo sekrecijo iz celic. Njihova platforma za odkrivanje boljših signalnih peptidov bi lahko ostala uporabna tudi za optimizacijo drugih terapevtskih protiteles v prihodnosti.