Čiščenje rekombinantnih protiteles z obarjanjem z etanolom

Uvod

Čiščenje rekombinantnih humaniziranih protiteles (nadalje: rhAb) poteka z uporabo afinitetne kromatografije s proteinom A. Ta proces je drag in v luči novih odkritij na področju priprave rekombinantnih protiteles bo potreba po njihovi uporabi kmalu velika, zato je pomembno, da se postopek čiščenja poceni. Za razliko od čiščenja rhAb je postopek za čiščenje intravenoznih imunoglobulinov, ki se uporabljajo za preprečevanje infekcij pri bolnikih z oslabljenim imunskim sistemom, dokaj poceni. Postopek čiščenja imunoglobulinov temelji na t. i. Cohnovem procesu, ki se uporablja že od druge svetovne vojne. Cohnov proces, danes seveda optimiziran, je proces frakcionacije krvne plazme s serijo obarjanj s hladnim etanolom. V procesu spreminjajo pH, ionsko moč, koncentracijo etanola in temperaturo ter tako dosežejo selektivno obarjanje različnih plazemskih proteinov. Raziskovalci iz Dunaja in Švice so dokazali, da se lahko, z nekaterimi prilagoditvami, čiščenje rhAb izpelje s serijo obarjanj s hladnim etanolom.

Namen

Optimizacija klasične metode obarjanja z etanolom za pripravo intravenoznih imunoglobulinov, tako da se lahko metoda uporabi za čiščenje rhAb.

Potek dela in rezultati

Tscheliessnig in sodelavci so se eksperimenta lotili tako, da so pripravili faktorski načrt. Slednje pomeni, da so preverili vpliv različnih parametrov in interakcije med njimi. Upoštevali so naslednje parametre: pH (6,5 ali 8,5), koncentracija etanola (30 % ali 40 %), temperatura (9 °C ali -10 °C), tip soli (NaCl ali CaCl2) in prevodnost (brez soli ali 40 mS/cm z dodano soljo). Vpliv parametrov se preizkusili na treh različnih rhAb (rhAb1, rhAb2 in rhAb3), ki imajo različne izoelektrične točke. Protitelesa so pripravili v sesalski celični liniji CHO in očistili iz supernatanta. Vse eksperimente so ponovili trikrat, vpliv parametrov na topnost rhAb, DNA in proteinov iz gostiteljskega organizma (angl. Host cell proteins - HCP) pa so določili glede na njihovo koncentracijo v supernatantu po obarjanju.

Po izvedbi eksperimentov so odkrili, da na topnost vseh treh rhAb najbolj vplivata temperatura in koncentracija dodanega etanola. Slednjega so dodajali počasi, v obdobju štirih ur, da so se izognili nastajanju agregatov. Odkrili so tudi povezavo med temperaturo in prevodnostjo; nižja kot je temperatura, višja je prevodnost in manjša je topnost rhAb. Na topnost rhAb pH nima velikega vpliva. Topnost rhAb1 in rhAb2 je odvisna tudi od tipa uporabljene soli. Topnost DNA je v največji meri odvisna od temperature, topnost HCP pa je odvisna tudi od koncentracije soli.

Glede na rezultate so oblikovali pet oziroma šest (za rhAb3) različnih strategij in preverili njihovo uspešnost pri čiščenju posameznega rhAb. Vsaka strategija je vsebovala tudi korak obarjanja s CaCl2, nujen za odstranitev večine DNA in tudi nekaterih HCP. Izmed vseh strategij se je za čiščenje vseh treh rhAb najbolje obnesla »strategija A«, ki vključuje dvakratno obarjanje s hladnim etanolom in dvakratno obarjanje s CaCl2 pri različnih pH. Z uporabo te strategije so dosegli tudi 155-kratno zmanjšanje deleža HCP v primerjavi z deležem v supernatantu pred serijo obarjanj.

Želja raziskovalcev je bila odkriti tak proces, ki bi se lahko rutinsko uporabljal v industriji. V ta namen so »strategijo A« preizkusili tudi na večjem volumnu supernatanta; 70 ml. Zaradi večjega volumna so morali uvesti tudi nekatere prilagoditve; da so dosegli željeno prevodnost, ki je nadalje ni bilo več potrebno kalibrirati, so uporabili 250 mM CaCl2. Obarjanje s CaCl2 so izvedli pri sobni temperaturi in izpustili so spiranje supernatanta po prvem obarjanju s hladnim etanolom. Strategijo so preizkusili tudi na rhAb4. Izkazalo se je, da je bil izkoristek posameznega rhAb različen; 64 % rhAb1, 80 % rhAb2, 83 % rhAb3 in 76 % rhAb4. Za vsa protitelesa, razen rhAb3, so dosegli več kot 99 % čistost. Pri slednjem je bila strategija najmanj uspešna saj je bilo znižanje deleža HCP le 20-kratno, poleg tega pa so se, kljub počasnemu dodajanju etanola, tvorili tudi agregati.

Čistost rhAb in še dodatno znižanje deleža HCP so dosegli z uvedbo dodatnega koraka; anionske izmenjevalne kromatografije. Korak so preizkusili na rhAb2 in dosegli 300-kratno znižanje deleža HCP, kakor tudi znatno znižanje deleža DNA v primerjavi z deležem v supernatantu pred serijo obarjanj.

Zaključek

Tscheliessnig in sodelavci so razvili metodo, ki predstavlja alternativo klasični metodi za čiščenje rekombinantnih humaniziranih protiteles. S statistično zasnovano analizo so preverili vpliv pomembnih parametrov na topnost rhAb, DNA in HCP. S tem ko so metodo izvedli zaporedoma so dosegli primerno čistost rhAb in se prav tako znebili večine DNA in HCP. S tem ko so metodo preizkusili na večjem volumnu supernatanta so dokazali, da je metoda aplikativna v industrijskem merilu. Čeprav je čiščenje rhAb na ta način zamudnejše kot je čiščenje z afinitetno kromatografijo, je razvita metoda ekonomsko bolj ugodna in zahteva le uporabo osnovnih laboratorijskih materialov ter aparatur.

Viri

1. Tscheliessnig, A., Satzer, P., Hammerschmidt, N., Schulz, H., Helk, B. & Jungbauer, A. (2014). Ethanol precipitation for purification of recombinant antibodies. Journal of biotechnology 188C, 17–28

2. Hammerschmidt, N., Tscheliessnig, A., Sommer, R., Helk, B. & Jungbauer, A. (2014). Economics of recombinant antibody production processes at various scales: Industry-standard compared to continuous precipitation. Biotechnology journal 9, 766–75

3. Radosevich, M. & Burnouf, T. (2010). Intravenous immunoglobulin G: trends in production methods, quality control and quality assurance. Vox sanguinis 98, 12–28