Razvoj pegiliranih lipopleksov proti E6 za aplikacijo na sluznico pri predrakavih spremembah materničnega vratu

UVOD

Glavno vlogo pri nastanku raka materničnega vratu ima humani papilomski virus (HPV), ki okuži ploščate epitelijske celice v sluznici. HPV je majhen virus brez ovojnice, njegov genom je krožna dsDNA. Za nastanek raka sta ključna virusna proteina E6 in E7. E6 se veže na tumor-supresorski protein p53, kar povzroči njegovo ubikvitinacijo in razgradnjo. V normalnih razmerah p53 povzroči zaustavitev celičnega cikla v fazi G1, popravljanje DNA ali apoptozo; pri okužbi s HPV pa je njegova funkcija onemogočena. E7 pa se veže na tumor-supresor pRb in s tem prepreči njegovo vezavo na transkripcijski faktor E2F, to pa povzroči prepisovanje genov, ki so odgovorni za vstop v fazo S celičnega cikla. Zaradi tega pride do prekomerne proliferacije in kopičenja mutacij, ki lahko vodijo v maligno transformacijo celice. Na podlagi zaporedja DNA so odkrili okrog 200 tipov virusa, večina povzroča benigne spremembe celic, nekateri od njih pa predstavljajo visoko stopnjo tveganja za nastanek raka (predvsem tipa 16 in 18, tudi 31, 33 in 35, vendar so ti redkejši).

NAMEN RAZISKAVE

Za preprečevanje raka materničnega vratu so že v uporabi učinkovita cepiva proti HPV, vendar se število primerov raka kljub temu ne bo znižalo še naslednjih 15-20 let, zato je nujno poiskati alternativno pot zdravljenja. V predhodnjih raziskavah so ugotovili, da utišanje genov za E6 in E7 z siRNA povzroči senescenco ali apoptozo celic. Aplikacija gole siRNA ni primerna, saj ne prehaja preko sluznice, prav tako pa se zelo hitro razgradi, zato je potrebno razviti učinkovit dostavni sistem. Ena izmed možnosti je lokalna aplikacija pegiliranih lipopleksov, na katere je vezana siRNA, usmerjena proti mRNA za E6 (siE6). Metoda je primerna za zdravljenje predrakavih sprememb materničnega vratu, ne pa tudi za zdravljenje napredovane oblike raka. Prednosti aplikacije na sluznico so uporaba nizkih doz zdravila, zmanjšano tveganje za sprožitev imunskega odziva, aplikacija direktno na mesto delovanja, izogibanje predsistemskemu metabolizmu zdravila (učinku prvega prehoda) in zmanjšanje toksičnosti. Sluznica je pomembna pri obrambi telesa pred raznimi patogenimi organizmi in drugimi tujimi delci, ki se vežejo nanjo preko vodikovih, hidrofobnih ter elektrostatskih vezi in se nato izločijo iz telesa. Ugotovili so, da lahko sluznico prehajajo nanodelci, veliki 200-500 nm, če so prekriti s polietilen glikolom (PEG) - nenabit hidrofilni polimer, ki zmanjša interakcijo nanodelcev s sluznico. V raziskavi so pripravili pegilirane lipoplekse, na katere je vezana siE6. Preverili so njihove fizikalno-kemijske lastnosti, učinkovitost transfekcije celic, učinkovitost znižanja ravni izražanja E6 in zvišanja ravni izražanja p53.

POSTOPEK DELA IN REZULTATI

Najprej so pripravili kationske liposome iz lipidov DOTAP, holesterola in DOPE. Liposomom so dodali siRNA, ki se je zaradi negativnega naboja nanje spontano vezala, tako so dobili lipoplekse. Te so pegilirali z dodatkom DSPE-PEG2000. Preverili so njihove fizikalno-kemijske lastnosti (povprečni premer, zeta potencial, indeks polidisperznosti) in ugotovili, da so primerni za prehod preko sluznice. Z lipopleksi (brez PEG) in pegiliranimi lipopleksi (50 in 100 nM) so transficirali celice. Uporabili so celično linijo CaSki (HPV 16-pozitivne celice iz metastatskega karcinoma materničnega vratu). Nato so preverili učinkovitost utišanja gena za E6 in ekspresije tumor-supresorskega proteina p53. Ugotovili so, da je prišlo do 36 % (50 nM) oz. 48 % (100 nM) znižanja ravni izražanja mRNA ob uporabi lipopleksov in do 29 % (50 nM) oz. 28 % (100 nM) znižanja ravni izražanja mRNA ob uporabi pegiliranih lipopleksov. Prav tako je prišlo do ekspresije p53, ponovno se je izkazalo, da so lipopleksi (brez PEG) učinkovitejši kot pegilirani lipopleksi.

ZAKLJUČEK

Znanstveniki so razvili pegilirane lipoplekse z vezano siE6, ki so zaradi svojih fizikalno-kemijskih lastnosti primerni za aplikacijo na vaginalno sluznico pri zdravljenju predrakavih sprememb materničnega vratu. Z uporabo na celični liniji CaSki so uspešno utišali izražanje virusnega proteina E6 in inducirali ekspresijo tumor-supresorja p53. Ugotovili so, da je učinkovitost pegiliranih lipopleksov sicer malo slabša kot učinkovitost nepegiliranih lipopleksov, vendar je dodatek PEG nujen za prehod lipopleksov preko sluznice.