Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za proizvodnjo biogoriva in kemikalij iz maščobnih kislin

UVOD

Kot posledica bolj očitnih efektov globalnega segrevanja in omejenosti fosilnih goriv, so metabolni inženirji začeli iskati bolj zelene vire goriv. Mikrobna proizvodnja visoko energetskih goriv preko ekonomsko učinkovitih in okoljsko sprejemljivih bioprocesih se je v zadnjem času pokazala kot izvedljiva alternative konvencionalni proizvodnji goriv za transport. Visoko energetske molekule za biogoriva trenutno pridobivajo iz rastlinskih olj in živalskih maščob. Ampak so se v zadnjih časih cene hrane povišale, kar je ponovno obudilo debato o tem ali naj agrokulturske vire porabljamo za energetski sektor ali prehrambeno industrijo.

Določene vrste kvasovk in mikroalg so sposobne akomulirati maščobne kisline v nevtralni obliki kot triacilglicerol (TAG) tja od 30 – 70 % suhe celične teže. S. cerevesiae akomulira manj MK, vendar nam ponuja nekaj prednosti pred oljnim kvasovkam in mikroalgam kot gostiteljski sistem za produkcijo maščobnih kislin in derivatov. De novo biosinteza maščobnih kislin v kvasovki zahteva acetil-CoA karboksilazo (ACC) in maščobno kislinsko sintazni kompleks (FAS; kodiran s FAS1 in FAS2). ACC pretvori acetil koencim A v malonil-CoA. Nato FAS kompleks združi en acetil-CoA in 7-8 malonil-Coa v C16-C18 maščobno kislinski CoA. Biosinteza maščobnih kislin je regulirana na večih nivojih. Že zelo nizke koncentracije (K=1-5nM) končnega produkta z negativno povratno zanko zavrejo delovanje ACC. Zato je potrebno maščobno kislinski CoA odstraniti, če hočemo proizvesti čim več te energetsko bogate molekule.

REZULTATI

V raziskavi opisana v članku so sintetizirali in skušali izraziti v čim večjih količinah štiri produkte in sicer triacilglicerol (TAG), proste maščobne kisline, maščobne alkohole in maščobni kislinski etil estrov (FAEE). Prve študije so nakazale, da je v biosintezni poti prvi korak omejujoč. Zato so prekomerno izrazili encim ACC v kvasovki S.cerevisiae. Tako so dobili 58 % več lipidov (iz 4,3 na 6,8 % suhe celične teže) in produkcijo maščobnih kislin iz 42,7 na 63,2 mg/L. Nato so posebej prekomerno izrazili še FAS kompleks in dosegli izboljšanje vsebnosti lipidov za 30 % (iz 4,3 na 5,6 %) ter produkcijo maščobnih kislin iz 42,7 na 70,6 mg/L. Ker pa končni produkt negativno regulira ACC, so se odločili, da posebej prekomerno izrazijo še encim diacilglicerol-aciltransferaza (DGAT), ki pretvori maščobno kislinski CoA v TAG. Vsebnost lipidov se je povečala za kar 150 % (4,3 na 10,9 %) in produkcija maščobnih kislin iz 42,7 mg/L na 168,3. Nato pa so poskusili prekomerno izraziti vse tri gene, ki sodelujejo pri biosintezi maščobnih kislin. Ker so geni kar veliki (ACC, 6702bp; FAS1 6156bp, FAS2 5664 bp), so se odločili, da za metodo kromosomske zamenjave. Promotorje so zamenjali s TEF1 promotorjem, ki je močan in konsistenten. To celično linijo so imenovali WRY1. Vsebnost lipidov se je dvignila za 230 % (4,3 na 14,2 %) in produkcijo maščobnih kislin iz 42,7 na 155,0 mg/L. Pri DGAT pa prisotnost TEF1 promotorja ni povišalo ekpresijo, zato so se odločili, da uporabijo plazmid z 2µ ORI, kar nam da večjo število kopij na celico. Pri tej pa se je vsebnost lipidov dvignila za 302 % (4,3 na 17,3 %) in produkcijo MK iz 42,7 na 171,5 mg/L. ß-oksidacija sodeluje pri razgradnji maščobnih kislin. Zato so poskusili z delecijam genov ß-oksidacije, vendar se rezultati niso izboljšali. Nato so poskusili s proizvodnjo prostih maščobnih kislin. Namesto DGAT so prekomerno izrazili acil-ACP tioesterazo. Transformacija v wt kvasovko povzroči 8x povečanje (iz 0,6 na 5 mg/L prostih MK). Če pa uporabimo WRY1 linijo pa se koncentracija poviša na 52 mg/L. Ker pa encim acil-CoA sintetaza uporabi proste maščobne kisline, so dva gena deletirali. V sevu WRY1 je taka delecija povzročila, da je sev proizvedel 400 mg/L prostih MK. Ta dva produkta ne moremo direktno uporabiti za biogoriva, zato so raziskovalci poskusili še z dvema encimoma, ki katalizirata reakcijo do maščobnih alkoholov in maščobno kislinskih etil estrov (FAEE). Prekomerna ekpresija maščobne acil-CoA reduktaze, ki pretvori maščobno kislinski CoA v maščobni alkohol (porabi NADPH), v wt kvasovki dvigne vsebnost maščobnih alkoholov na 47,4 mg/L. V sevu WRY1 pa 93,4 mg/L. Sumili so, da je lahko koncentracija NADPH omejujoč faktor, zato so v kvasovki izrazili še od NADP odvisni malik encim (malat + NADP+  piruvat + NADPH). Dobili so 98,0 mg/L maščobnih alkoholov. Pri sintezi FAEE so uporabili encim wax-ester sintetaza. V wt so dobili 1,2 mg/L produkta, v sevu WRY1 pa 4,6 mg/L.

ZAKLJUČEK

Biogoriva in kemikalije pridobljene iz maščobnih kislin so v velikem povpraševanju. V članku so hoteli dokazati, da je S. cerevisiae primerna za scale-up, kontroliran in ekonomičen model za pridobivanje pomembnega razreda kemikalij.