Neposredno popravljanje mutacij

Neposredno popravljanje mutacij

Popravljalni mehanizmi, ki potekajo po pojavitvi napak na DNA, večinoma vodijo preko odstranitve poškodovanih nukleotidov in nato ponovne sinteze manjkajočih delov v zaporedju. Določene vrste poškodb se lahko popravijo preko neposrednega obratnega mehanizma pojavitve napake. Neposredno obratno popravljanje mutacij ne vključuje razdrtja fosfodiestrske verige in je učinkovit popravljalni mehanizem, čeprav je tarča razmeroma majhna modifikacija celotne DNA. Ne potrebuje ene od verig za sintezo zaporedja, je preprost in energetsko učinkovit, izvedljiv pa je v le določenih vrstah mutacij. To sta dimerizacija pirimidinskih, do katere pride ob izpostavljenosti UV sevanju, in pa alkilaciji gvaninskih ostankov, torej vezavi metilne ali etilne skupine na O6 atom purinskega obroča.

Ciklobutan pirimidin dimer fotoliaza

UV sevanje velja za enega ključnih virov pojavov poškodb na DNA, zato je z vidika pojava poškodb in sledečih popravljalnih mehanizmov tudi dobro raziskano. Velik del poškodb zaradi UV sevanja, je dimerizacija pirimidinov, ki si sledita po zaporedju, torej sta del iste verige dvojne vijačnice. Prekineta se dvojni vezi med paroma ogljikovih atomov 5 in 6, med sosednjima obročema se tvorijo vezi. Tako nastane ciklobutanski obroč z nasičenimi ogljikovimi atomi. Taka deformacija ukrivi obliko molekule in preprečuje replikacijo ter transkripcijo. Obstaja tudi druga oblika deformacije zaradi UV sevanja, in sicer dimerizacija preko tvorbe vezi med C6 enega in C4 drugega obroča, ob tem pa potečejo še dodatne kemijske spremembe na sosednjih C-atomih. Popravljalni mehanizem, ki napako popravi neposredno po obratni poti, se imenuje fotoreaktivacija. Poteče lahko le ob prisotnosti vira svetlobe, saj ta predstavlja vir energije, ki je potreben za razdor ciklobutanskega obroča. Odkritje obstoja takega postopka seje zgodilo že leta 1949 ob eksperimentih, katerih cilj je bila izolacija bakterij, odpornih na antibiotike. Ena od faz dela je bila izpostavitev kultur UV sevanju in preiskovanje preživelih bakterij. Čeprav naj bi bili pogoji v paralelkah enaki, je število preživelih bakterij znatno variiralo, in raziskovalcu Kelnerju je z veliko truda uspelo identificirati ključni faktor kot izpostavljenost svetlobi v obdobju po obsevanju. Še zanesljivejšo potrditev te hipoteze je kmalu za tem izvedel Dulbecco. Gojišča z bakterijami in fagi je po obsevanju gojil eno nad drugim z virom svetlobe na vrhu. Število preživelih plakov je padalo proti dnu, to pa je nato preveril še s popolno ločitvijo obsevanih kultur v razmere s svetlobo in brez, rezultati pa so ta odkritja potrdili. Sledile so raziskave na področju identifikacije tega mehanizma. Rupert je leta 1957 pokazal, da popravljalni postopek poteče, če izolirano DNA izpostavimo UV sevanju, nato pa dodamo bakterijski ekstrakt brez celic in vse skupaj izpostavimo vidni svetlobi. V letih za tem so dejansko odrkili pojav dimerizacije pirimidinskih obročev zaradi UV sevanja, nato pa tudi delovanje fotoreaktivacijskega encima, ki te napake neposredno popravi ob izpostavljenosti modri svetlobi (350-450 nm). Encim so poimenovali ciklobutan pirimidin dimer fotoliaza, in potrdili, da bakterije brez tega encima niso sposobne odpraviti dimerizacije pirimidisnkih obročev. Encim je prisoten v večini organizmov. Imajo ga arheje, bakterije, živali in rastline, odsoten pa je pri placentalnih sesalcih. Fotoliaza vsebuje pigment, ki absorbira svetlobo. Pigment na aktivnem mestu, omogoči uporabo energije za potek reakcije, poleg tega pa je v encimu prisoten še drugi pigment, ki je občutljiv na svetlobo drugih valovnih dolžin, ki ob aktivaciji prenese energijo na pigment na aktivnem mestu, tako se občutljivost razširi na svetlobo valovnih dolžin med 300 in 500 nm. To omogoči širše območje pogojev delovanja mehanizma in večjo učinkovitost glede na vir svetlobe. Pri delovanju encima igra v aktivnem mestu katalitsko vlogo kofaktor FAD, in sicer je aktiven v reducirani obliki FADH-, ki na začetku mestom dimerizacije donira elektron, po odcepitvi dimera pa radikal FADH• ponovno sprejme elektron. Kljub temu, da ob 6-4 dimerizaciji potečejo dodatne modifikacije na pirimidinskih obročih, kot popravljalni mehanizem to neposredno obratno popravi ena sama fotoliaza, ki so jo odkrili leta 1993. Ker pri cepitvi dimera pride do več kemijskih sprememb in prenosa skupin, je tudi mehanizem reakcij bolj zapleten. Za razliko od ciklobutan pirimidin dimer fotoliaze, so delovanje 6-4 fotoliaze so odkrili pri večini rastlin in živali, zaenkrat velja za odsotno pri sesalcih in bakterijah. Čeprav določeni organizmi nimajo nobene od opisanih fotoliaz, so posledice UV sevanja na DNA še vedno popravljive, in sicer preko odcepitve poškodovanih nukleotidov in njihove zamenjave.

Samomorilne alkiltransferaze

Neposredni popravljalni mehanizmi poleg dimerizavije pirimidinov ob izpostavljenosti UV sevanju lahko obratno popravijo tudi mutacije, ki so posledice delovanja alkilirajčih reagentov. Ti vodijo do metilacije in etilacije nukleotidnih baz. Če metilacija poteče na O6 gvanina, se nastali metilgvanin več ne veže s prej komplementarnim citozinom, lahko pa tvori bazni par s timinom. Tako in ostale alkilacije neposredno po obratnem mehanizmu popravijo encimi, kot so O6-metilgvanin metiltransferaze, ki odvečno alkilno skupino prenesejo na lastne cisteinske ostanke. Alkilacijo lahko odpravijo tudi z mesta O4 na timinu ali s fosfatnih skupin na fosfotriestrih. Bolj specifičen primer takega encima je O6-alkilgvanin DNA alkiltransferaza I, ki je monomer, katerega C- in N-terminalna domena imata svoje aktivno mesto s cisteinom. Na N-terminalni domeni se alkil prenese s fosfatne skupine, na C-terminalni domeni pa z O6 atoma gvanina ali z O4 atoma timina. Za razliko od klasične definicije encima, je za te značilno, da po metilaciji cisteinskega ostanka ne pride do prenosa skupine drugam in s tem regeneracije encima. Iz tege izvira poimenovanje skupine samomorilni encimi. Prej opisani encim pa po alkilaciji ne izgubi svoje funkcionalnosti, igra vlogo aktivatorja genov, in sicer spodbuja translacijo svoje primarne oblike in tudi drugih encimov, ki so del popravljalnih mehanizmov DNA. Na novo sintetizirane alkiltransferaze opravljajo enako vlogo, če pa po njihov delovanju ni več potrebe, ostanejo njihovi cisteinski ostanki nealkilirani. V taki obliki igrajo vlogo inhibitorjev translacije tega in funkcijsko sorodnih genov. Delovanje O6-alkilgvanin DNA alkiltransferaze II je v prvi stopnji podobno, a obliki z metiliranimi in nemetiliranimi cisteinskimi ostanki ne igrata nobene vloge pri regulaciji translacije genov. Tako naj bi predvsem nadomeščal transferazo I, dokler ta ni na novo sintetizirana. Taki in podobni encimi so taksonomsko široko razširjeni med evkarionti in prokarionti, prisotni so tudi pri človeku. Evkariontske DNA alkiltransferaze prav tako ne igrajo vloge pri regulaciji transkripcije in so tako podobnejši prokariontski transferazi II. Poznavanje delovanja DNA alkiltransferaz pri človeku je pomembno pri raziskavah raka. Poleg tega, da njihovo pravilno delovanje znižuje možnost pojava rakastih celic ob izpostavljenosti DNA alkilirajočih sredstev, imajo tudi pomemben vpliv na uspešnost kemoterapije. Številni kemoterapevtiki to DNA alkilirajoča sredstva. Tako ta niso učinkovita ob visoki aktivnosti DNA alkiltransferaz v rakastih celicah, hkrati pa so preveč destruktivna za sosednje zdrave celice, če imajo te nizko prisotnost alkiltransferaz.

Oksidativna dealkilacija z dioksigenazami

Dealkilacija preko samomorilnih alkiltransferaz pa edini mehanizem odpravljanja vezanih alkilnih skupin na DNA. Leta 2002 so pri E. Coli odkrili mehanizem oksidativne dealkilacije z N atomov na modificiranih adeninu in citozinu, v manjši meri tudi na timinu in gvaninu. Cepi metilne, etilne in etenilne skupine. Poleg DNA učinkujejo tudi na RNA molekule in so na splošno učinkovitejše na mestih, kjer je izpostavljena ena veriga, saj skoraj ne interagirajo s komplementarno verigo, modificiran del pa izpostavijo z zasukom verige. Sodelujoč encim AlkB sodi v skupino α-ketoglutaratnih od železa odvisnih dioksigenaz. Ta preko železa (II) aktivira kisik, ki nato oksidira metilnukleotid in cepi vezi med dušikom in ogljikom, produkt pa nato v vodni raztopini razpade na formaldehid in regeneriran nukleotid. Oksidativna dealkilacija poteka pri večini organizmov, morda vseh, tudi pri ljudeh. Odkritje teh encimov je vodilo v raziskave encimov, ki železa ne vežejo preko hema, zaradi česar so sledila odkritja na področju epigenetskih modifikacij na hitsonih.

Viri

1. B.E. Tropp: Principles of Molecular Biology, 1. izdaja. Burlington: Jones & Bartlett Learning, 2014.

2. Cooper GM. The Cell: A Molecular Approach. 2nd edition. Sunderland (MA): Sinauer Associates; 2000.

3. Mishina, Yukiko, Erica M. Duguid, and Chuan He. “Direct Reversal of DNA Alkylation Damage.” Chemical reviews 106.2 (2006): 215–232. PMC. Web. 22 May 2016.

4. http://cshperspectives.cshlp.org/content/5/1/a012575.full