Z majhnimi molukulami regulirani ogrodni proteini

iGEM 2016: TU Eindhoven - Small molecule mediated scaffolds

Ogrodni proteini, ki regulirajo in usmerjajo združevanje drugih proteinov v celici, igrajo izredno pomembno vlogo v celični signalizaciji. Ker interferirajo s številnimi drugimi proteini in tako regulirajo tudi transkripcijo pomembnih genov, se mnogi ogrodni proteini pogosto uporabljajo v sintezni biologiji.

Ogrodni proteini 14-3-3

Proteini 14-3-3 so ogrodni proteini, ki specifično vežejo motive s fosforiliranimi oblikami aminokislinskih ostankov serina in treonina v tarčnih proteinih. Obenem gre za družino proteinov, ki je močno evolucijsko ohranjena v vseh evkariontskih celicah, večina organizmov pa vsebuje več različnih, vendar strukturno dokaj podobnih izoform, ki navadno tvorijo homo- ter heterodimere. Takšna raznolikost izoform omogoča vezavo številnih interakcijskih partnerjev – do sedaj je bilo identificiranih več kot 200 signalnih proteinov [1].

Proteini 14-3-3 iz tega razloga sodelujejo pri velikem številu bioloških procesov, kot so npr. napredovanje in kontrola celičnega cikla, apoptoza, metabolizem, transkripcija in regulacija izražanja genov ter popravljanje napak DNA [2].

Funkcije proteinov 14-3-3 lahko uvrstimo v štiri glavna področja delovanja, in sicer je najbolj osnovna funkcija teh ogrodnih proteinov združevanje komponent posamezne signalne kaskade in s tem izboljšanje njene učinkovitosti. Povezava proteina 14-3-3 in tarčnega proteina na tak način stabilizira tudi proteinske komplekse, sproži pa lahko tudi konformacijske spremembe vezanega proteina in s tem regulira njegovo encimsko aktivnost. Še ena pomembna funkcija je lokalizacija signalnih molekul na specifičnem območju oz. mestu v znotrajceličnih organelih, kar je lahko pomembno za sintezo določenih intermediatov, proteini 14-3-3 pa so pomembni tudi iz stališča regulacije pozitivnih in negativnih povratnih zank. Ne nazadnje lahko objamejo tudi določeno regijo tarčnega proteina in tako preprečijo interakcije z drugimi molekulami (npr. z DNA ali proteini) ali pa vezan protein zaščitijo pred defosforilacijo in proteolitsko razgradnjo [1,2,3].

Projekt

V ekipi iGEM iz TU Eindhoven so pri svojem raziskovalnem delu na področju sintezne biologije opisane lastnosti izkoristili v ta namen, da so razvili nove variante ogrodnih proteinov – heterodimerne ter tetramerne variante, s čimer so poskušali doseči regulacijo več različnih proteinskih interakcij.

Pri tem so uporabili ogrodni protein T14-3-3, ki izvira iz rastline Nicotiana plumbaginifolia (tobak). Ta dimerni protein interagira z 52 aminokislinskih ostankov dolgim proteinom CT52, ki v resnici predstavlja izoliran C-končni citosolni del H+-ATPaze iz plazemskih membran rastlinskih celic (aminokislinski ostanki 905-956). Interakcija T14-3-3 se vzpostavi s prostim C-koncem CT52 in je stabilizirana z dodatno vezavo majhne organske molekule fuzikokcina [4].

Funkcionalnost svojih konstruktov so nato analizirali s posebnimi reporterskimi sistemi. Na prost N-končni del proteina CT52 so vezali določene proteine, ki so pod vplivom fuzikokcina dimerizirali na ogrodnih proteinih in s tem dokazali funkcionalnost le-teh.

Modeliranje proteinov T14-3-3 in CT52

Raziskovalci so nove variante ogrodnih proteinov zasnovali na podlagi računalniških modelov in pri tem uporabili program Rosetta software package. Na proteinu T14-3-3 so tako zasnovali štiri sete mutacij. Poleg že znane mutacije T14-3-3-E19R, ki je v sledečih eksperimentih služila kot pozitivna kontrola, so v posamezna zaporedja proteinov uvedli še računalniško predvidene mutacije S71L in I72V, S71L in W237R.

Komplementarne mutacije so vnesli tudi v zaporedje proteina CT52. Poleg že znane mutacije K943D so načrtali tri nove mutacije I947F, I947H in S953K ter s tem v kasnejših eksperimentih zagotovili ustrezno ortogonalnost s proteini T14-3-3.

Načrtovanje dimerov T14-3-3

Nove heterodimerne proteine so sestavili iz dveh monomernih enot, pri čemer je ena od teh predstavljala divji tip proteina T14-3-3, druga monomerna enota pa je vsebovala eno oz. dve mutaciji aminokislinskih ostankov, ki so ključni za vezavo proteinov CT52.

Načrtovanje tetramerov T14-3-3

V naslednji fazi so načrtali tetramer proteina T14-3-3, ki se sicer v naravi pojavlja le v dimerni obliki. Takšni ogrodni proteini naj bi bili sposobni združiti štiri tarčne proteine CT52, poleg tega pa bi imeli številne funkcije. Med drugim bi delovali kot izboljšan sistem za sprožitev celične smrti in sistem za produkcijo ter dostavo bioloških zdravil, sodelovali pa bi naj tudi pri regulaciji sistema CRISPR/Cas9.

Pri načrtovanju so tetramere razdelili v dve skupini, in sicer v homotetramere, ki so sestavljeni iz štirih enakih monomernih enot divjega tipa proteina T14-3-3, ter v heterotetramere, ki vključujejo štiri različne monomere. V projektu so te monomerne enote predstavljali divji tip proteina T14-3-3 in tri mutirane oblike (T14-3-3-S71L-I72V, T14-3-3-W237R in T14-3-3-E19R).

Tetramere so zasnovali na podlagi povezovanja dveh dimernih enot preko povezovalne regije GGS10 z zaporedjem Gly-Gly-Ser, ki se desetkrat ponovi, tak tetramer pa na podlagi štirih vezavnih mest oz. žlebov omogoča vezavo in združevanje kar štirih tarčnih proteinov.

Poskusi in rezultati

Dimeri T14-3-3

Funkcionalnost dimerov so analizirali s sistemom NanoLuc Luciferase. Gre za reporterski sistem, ki ga sestavljata dva različna in neaktivna fragmenta SmallBiT in LargeBiT. Proteini T14-3-3 omogočajo, da se ta posamezna fragmenta povežeta in s tem tvorita aktivno luciferazo NanoLuc, ki ob prisotnosti substrata furimazina emitira svetlobo [5].

V projektu so pripravili 10 različnih fragmentov. Fragmenta SmallBiT in LargeBiT so preko povezovalne regije GGS10 vezali na prosti N-konec posameznih variant proteina CT52 in te zapise vstavili v vektor pET28a. Po izražanju v E. coli so se povezani proteini ob prisotnosti fuzikokcina vezali na heterodimerne ogrodne proteine. S tem so posledično aktivirali sistem NanoLuc in omogočili emisijo bioluminiscenčne svetlobe z valovno dolžino 460 nm.

V prvi fazi so z merjenjem relativne intenzitete posameznih kompleksov dimernega ogrodnega proteina T14-3-3 in ustreznih vezavnih proteinov CT52 z mutacijami, ki so jih predvideli na podlagi predhodnega modeliranja, najprej preverili funkcionalnost in uspešnost povezovanja teh proteinov.

Pri analizi rezultatov so ugotovili, da je bila v primeru homodimera s povezanimi monomernimi enotami divjega tipa izmerjena intenziteta luminiscence bistveno manjša kot v večini ostalih primerov. Delca NanoBiT sta bila pri tem vezana na identična proteina CT52, zaradi česar je posledično lahko prišlo do vezave dveh delcev SmallBiT ali dveh delcev LargeBiT na en ogrodni dimerni protein.

V primeru heterodimera T14-3-3 z mutacijo W237R se bioluminiscenca v primerjavi z negativno kontrolo ni povečala, kar nakazuje na to, da se interakcije med ogrodnim proteinom in proteinom CT52 niso vzpostavile. V ostalih primerih so heterodimeri z uvedenimi mutacijami S71L, S71L in I72V ter E19R dali visoke vrednosti bioluminiscence, kar dokazuje pravilno tvorbo kompleksa NanoLuc in s tem funkcionalnost ogrodnih proteinov.

V naslednji fazi so preverjali vpliv koncentracije ogrodnih proteinov pri tvorbi kompleksov. Pri višjih koncentracijah so pričakovali povečano vezavo CT52 in s tem uspešno dimerizacijo obeh delcev NanoBiT, posledično pa se je povečala tudi izmerjena intenziteta bioluminiscence. V primerih, ki so se v predhodni analizi heterodimerov izkazali za funkcionalne (mutacije S71L, S71L in I72V ter E19R), so tudi v tem eksperimentu ustrezali pričakovanim rezultatom, saj se je intenziteta bioluminiscence povečevala z višanjem koncentracije ogrodnih proteinov T14-3-3.

Tetrameri T14-3-3

Skupina iGEM je načrtan tetramer poskušala izraziti in podrobno ovrednotiti z merjenjem kaspazne aktivnosti. Možnost povezovanja štirih proteinov na tetrameru T14-3-3 namreč omogoča regulacijo celične smrti, sprožitev tega procesa pa je odvisna od aktivacije prokaspaz-9, pri čemer posamezne prokaspaze dimerizirajo in s tem aktivirajo druga drugo.

V skupini so zato kaspazo-9 preko povezovalne regije GGS10 vezali na prosti N-konec proteina CT52, zapis ponovno vstavili v vektor pET28b in ga nato izrazili v bakterijah E. coli. Aktivnost kaspaz-9 so preučevali z uporabo fluorogenega substrata Ac-LEHD-AFC. Kaspaze-9 ta substrat razcepijo na nefluorescirajoči peptid in del, ki fluorescira, merjenje fluorescence pa tako po vezavi na ogrodni protein daje informacijo o aktivnosti kaspaz-9 in s tem posredno tudi o funkcionalnosti T14-3-3.

Člani skupine so želeli primerjati aktivnost dimerov in tetramerov ter ob tem preveriti tudi aplikacijo ogrodnih proteinov pri stikalu smrti. Pričakovali so, da bodo tetrameri učinkoviteje aktivirali kaspaze-9, saj na nek način kažejo večjo podobnost z apoptosomi, ki se v procesu apoptoze sestavijo v obliki septamera, poleg tega pa združevanje štirih hibridnih proteinov zagotovi višjo lokalno koncentracijo kaspaz-9 in posledično tudi hitrejšo ter bolj zanesljivo aktivacijo.

Zaradi težav pri kloniranju ekipa ni uspela pravočasno dokončati analize. V vektor pET28a jim je sicer uspelo vnesti dva DNA konstrukta tetramerov – homotetramer in heterotetramer, kar so potrdili tudi s sekvenciranjem in z agarozno gelsko elektroforezo. Pri tem sta oba konstrukta predstavljala liso pri okrog 9000 baznih parov, kar se načeloma ujema z dolžino obeh tetramernih konstruktov (8929 baznih parov).

Kljub temu, da jim tetramera T14-3-3 ni uspelo izraziti, pa so aktivacijo kaspaz-9 preko ogrodnih proteinov vendarle preverili pri homodimeru in izkazalo se je, da prisotnost ogrodnih proteinov vpliva na izrazito povečanje kaspazne aktivnosti.

Zaključek

Rezultati kažejo na to, da je ekipa iGEM svoj teoretični model pretvorila v uspešno delujoč in vitro sistem. Kljub temu, da so tetramer sintetizirali le na ravni DNA, pa nadaljnje raziskave in delo v tej smeri predstavljajo temelj za številne aplikacije na področju sintezne biologije, predvsem na področju regulacije proteinskih kompleksov.

Poleg že znanih biokock SmallBit in LargeBiT, ki so jih preko vezave na protein CT52 izboljšali v smislu karakterizacije in možnosti uporabe, so člani ekipe v svojem projektu ustvarili še 6 novih biokock, ki so kompatibilne s sintezno-biološkimi standardi. Štiri biokocke so heterodimeri T14-3-3, pri katerih eno monomerno enoto predstavlja divji tip T14-3-3, drugo podenoto pa protein z mutacijo, ostali dve biokocki pa predstavljata protein, ki je pripet na prosti N-konec vezavnega proteina CT52.

Viri

1. Obsil, T. & Obsilova, V. Structural basis of 14-3-3 protein functions. Semin. Cell Dev. Biol. 22, 663–672 (2011). 2. van Hemert, M. J., Steensma, H. Y. & van Heusden, G. P. H. 14-3-3 proteins: key regulators of cell division, signalling and apoptosis. BioEssays 23, 936–946 (2001). 3. Shaw, A. S. & Filbert, E. L. Scaffold proteins and immune-cell signalling. Nat. Rev. Immunol. 9, 47–56 (2009). 4. Ottmann, C. et al. Structure of a 14-3-3 Coordinated Hexamer of the Plant Plasma Membrane H+-ATPase by Combining X-Ray Crystallography and Electron Cryomicroscopy. Mol. Cell 25, 427–440 (2007). 5. Kim, J. & Grailhe, R. Nanoluciferase signal brightness using furimazine substrates opens bioluminescence resonance energy transfer to widefield microscopy. Cytom. Part A 89, 742–746 (2016). 6. 2016 iGEM team from Eindhoven University of Technology