Mehanizem delovanja kinolonov

Zgodovina razvoja kinolonov

V laboratorijih Georga Leshera so leta 1962 kot stranski produkt sinteze antimalarika odkrili nalidiksno kislino, predhodnico velike skupine antibiotikov, imenovanih kinoloni, ki je izkazovala baktericidne učinke. V naslednjih letih so nalidiksno kislino uvedli v zdravljenje zapletenih okužb sečil, sintetizirali še nekaj podobnih derivatov, ki jih danes uvrščamo v prvo generacijo kinolonov (cinoksacin, oksolinska kislina), kasneje pa z uvedbo fluorovega atoma na šesti ogljikov atom osnovnega ogrodja znatno izboljšali in razširili učinkovitost teh spojin, ki jih zato pogosto imenujemo tudi fluorokinoloni. S tem se je začela zlata doba kinolonov, dandanes najpogosteje uporabljenih antibiotikov širokega spektra, ki jih imensko prepoznamo po priponi -oksacin in s katerimi zdravimo resne okužbe sečil (Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli), spolno prenosljive bolezni (Neisseria gonorrhoeae), kožne infekcije (Staphylococcus aureus), intraabdominalne okužbe (Salmonella, Clostridium difficile), bronhitis (Mycoplasma pneumoniae), pljučnico (Streptococcus pneumoniae), tuberkulozo (Mycobacterium tuberculosis) – učinkoviti so torej pri okužbah z gramnegativnimi, grampozitivnimi in anaerobnimi bakterijami ter mikobakterijami in mikoplazmami. Njihovo rabo opuščamo zaradi možnih resnejših stranskih učinkov, predvsem poškodb sklepov, tetiv in živčnega sistema.

Odpornost bakterij

Pogosta uporaba kinolonov pri zdravljenju ljudi in živali je privedla do pričakovane, a zaskrbljujoče odpornosti bakterij, ki v zadnjih letih strmo narašča. Raziskave so prav tako zavrgle tradicionalno prepričanje, da je odpornost seva pridobljena s preživetjem celic, izpostavljenim visokim koncentracijam antibiotika, saj je tudi že zelo nizka koncentacija antibiotika dovoljšen selekcijski pritisk za pojav in prevlado odpornih bakterij. Zaradi nezadostnega aktivnega spremljanja ima znanstvena srenja skope podatke o pojavnosti in širjenju odpornosti, kar onemogoča učinkovite protiukrepe. Po nekaterih podatkih je tako na ciprofloksacin, klinično najpogosteje uporabljen kinolon, odporen že visok delež izolatov različnih bakterij: Escherichia coli (17 %, UK), Streptococcus pneumoniae (5 %, EU), Klebsiella pneumoniae (31 %, Azija), Shigella (11 %, Švica), Campylobacter spp. (24 %, svet), Neisseria gonorrheae (83 %, Koreja) in druge. Mnoge svetovne organizacije zato že nekaj časa pozivajo k zmanjšanem predpisovanju kinolonov in uporabi drugih antibiotikov širokega spektra kot prvo izbiro zdravljenja, čeprav se lahko geni za odpornost proti kinolonom ohranjajo in razširjajo v populaciji tudi na plazmidih, ki vsebujejo gene za odpornost proti drugim antibiotikom. Zaradi te kompleksne medsebojne povezanosti in mnogo nejasnih podrobnosti mehanizmov odpornosti bo znanost morala problem bakterijske odpornosti reševati s celovitim in integrativnim pristopom.

Mehanizem delovanja kinolonov

Kinoloni delujejo na bakterijsko DNA-girazo in topoizomerazo IV (topoizomerazi tipa II), ki modulirata topologijo DNA. Ob porabi ATP cepita dvovijačno DNA na enem fragmentu in nato prek razcepljenega dela translocirata drugi fragment iste DNA, s čimer spremenita njeno topološko razporeditev, ter za tem razcepljeni fragment ligirata. DNA-giraza med replikacijo in transkripcijo prokariontskih genov uvaja negativne dodatne zavoje v krožno DNA. Topoizomeraza IV skrbi za dekatenacijo novonastalih krožnih molekul DNA po replikaciji in s tem omogoča delitev bakterijskih celic. Obe topoizomerazi sta heterotetramera, sestavljena iz dveh funkcionalnih podenot, ki vsako tvorita dve enaki polipeptidni verigi (pri DNA-girazi GyrA in GyrB, pri topoizomerazi ParC in ParE). Dve različni podenoti tvorita eno aktivno mesto s tirozinom in dvema kataličnima magnezijevima ionoma, torej sta aktivni mesti dve, vsako za cepitev ene od verig DNA. Vezavno mesto za antibiotik se nahaja ob aktivnem mestu, kjer je prisoten vezavni žep. Za inhibicijo ene topoizomeraze sta potrebni dve molekuli kinolona. Antibiotik se sprva veže v vezavni žep prek mostička, ki ga tvorijo dvovalentni kovinski kation in dve molekuli vode. Karbonilni skupini kinolona in štiri molekule vode oktaedrično koordinirajo kovinski ion, dve molekuli vode, ki pri tem sodelujeta, pa tvorita vodikove vezi s serinskim in kislim aminokislinskim ostankom v žepu, ki sta med seboj oddaljena 3 aminokislinske ostanke. Evkariontski topoizomerazi IIα in IIβ nimata serinskega in kislega ostanka, zato kinoloni delujejo specifično proti bakterijam. Po nastanku cepitvenega kompleksa se kinolon interkalira v DNA in fizično prepreči ligacijo ter s tem povzroči trajno vezavo topoizomeraze na DNA in njeno fragmentacijo. Ko pride replisom do mesta z vezano topoizomerazo, se replikacija ustavi, nakar pri koncentraciji, ki presega zmogljivost popravljalnega mehanizma SOS, nastopi celična smrt. Odziv SOS, ki vključuje aktivacijo RecA in LexA, namreč prepozna enoverižne fragmente, nastale zaradi potovanja replikacijskih vilic ali transkripcijskega mehurčka do cepitvenega kompleksa, popravi poškodbe in s tem nasprotuje delovanju kinolonov. Posledično bi lahko sočasna inhibicija popravljalnih mehanizmov znatno izboljšala učinkovitost kinolonov. Podporni mehanizem je tudi povečana produkcija ROS zaradi fragmentacije DNA – nastane predvsem superoksidni radikal, ki dismutira v vodikov peroksid, ta pa po Fentonovi reakciji (Fe²⁺ + H₂O₂ → Fe³⁺ + •OH + OH^–) reagira do hidroksilnega radikala, ki naj bi bil odgovoren za letalnost. Ta mehanizem toksičnosti antibiotikov za bakterijske celice naj bi bil prisoten tudi pri delovanju drugih antibiotikov. Povečuje se tudi število dokazov, ki izpodbijajo predpostavljeno delovanje antibiotikov prek oksidativnega stresa, prav tako pa ni poznan točen mehanizem delovanja.

Posamezni kinolon pri neki bakterijski vrsti ne vpliva v enaki meri na obe topoizomerazi. Pri določenih vrstah je večji efekt na topoizomerazo IV, pri drugih na DNA-girazo, v vsakem primeru pa je baktericidnost večja, če ima sposobnost delovanja na oba encima. Prav tako ni opazna korelacija med grampozitivnostjo bakterije in dovzetnostjo posameznega encima za kinolone.

Mehanizmi odpornosti na kinolone

Bakterije so razvile več različnih mehanizmov, s katerimi zaobidejo delovanje kinolonov. Mutirani ali s plazmidom pridobljeni geni navadno omogočijo večjo stopnjo odpornosti, take bakterije pa imajo selekcijsko prednost in lahko nakopičijo še dodatne gene za rezistenco, s čimer nastanejo zelo odporni sevi. Mehanizme odpornosti lahko razdelimo v tri skupine: mutacije tarčnih encimov, mutacije, ki spremenijo izražanje genov za transport kinolonov v celico in iz nje, ter geni, ki omogočijo zaščito tarčnih encimov ali s kemijsko modifikacijo spremenijo kinolon.

Mutacije tarčnih encimov

Ustrezna mutacija giraze ali topoizomeraze IV onemogoči tvorbo mostička med kinolonom in proteinom ter tako zmanjša afiniteto kinolona do encima. Najpogostejši sta mutaciji ohranjenega serinskega ali bližnjega kislega ostanka v vezavnem žepu na GyrA ali ParC, ki sta ključna za tvorbo mostička. Manj pogoste so mutacije kislih ostankov na GyrB ali ParE, ki so udeleženi v stabilizacijo C7-skupine na kinolonu. V rezistentnih sevih sta ponavadi mutirani tako giraza kot topoizomeraza IV.

Zmanjšanje koncentracije kinolonov

Bakterije znižajo koncentracijo kinolonov z zmanjšanim izražanjem porinov, ki omogočajo difuzijo kinolonov v celico, ali pa s povečanim izražanjem transporterjev, ki črpajo kinolone iz celice. Pri gramnegativnih bakterijah je prepustnost membrane manjša, zato kinoloni v celico prehajajo skozi porina OmpF in OmpC. Njuno izražanje na membrani se zmanjša z mutacijami v regulatornih proteinih ali redkeje v strukturnih genih. Pogostejše so mutacije, ki povzročijo povečanje izhajanja kinolonov iz celice. Mutacije v regulatornih regijah transporterjev povečajo njihovo izražanje. Število transporterjev se lahko poveča tudi z geni za nove transporterje, pridobljenimi s plazmidom. Taka transporterja sta QepA in OqxAB. Porini in transporterji poleg kinolonov prenašajo tudi druge antibiotike, zato zmanjšano izražanje porinov in povečano izražanje transporterjev poveča odpornost tudi proti drugim antibiotikom, kar je pogost fenotip multirezistentnih bakterij.

Zaščita tarčnih encimov in modifikacija kinolonov

Poleg transporterjev se na plazmidih prenašajo tudi geni, ki ščitijo tarčne encime, in geni, ki z modifikacijo deaktivirajo kinolone. Proteini iz družine Qnr ščitijo girazo in topoizomerazo IV tako, da se nanjo vežejo in destabilizirajo kompleks med encimom, DNA in kinolonom. To zmanjša število nereligiranih dvojnih prelomov. Aminoglikozid acetiltransferaza aac(6′)-Ib-cr acetilira kinolone, ki vsebujejo piperidinski obroč, kot sta norflorksacin in ciprofloksacin. Acetilacija poteče na nesubstituiranem dušiku na piperidinskem obroču in zmanjša afiniteto antibiotika do encima. Odpornost proti kinolonom, ki se prenaša s plazmidi, je bila odkrita šele razmeroma pozno, vendar se zaradi horizontalnega prenosa plazmida hitro širi, geni za odpornost proti kinolonom pa se v plazmidih pogosto pojavljajo v kombinaciji z geni za odpornost proti drugim antibiotikom.

Prihodnost razvoja kinolonov

Zaradi selekcijskega pritiska se število sevov, odpornih proti kinolonom, nenehno povečuje. Ena izmed strategij v boju proti rezistenci je razvoj novih antibiotikov, ki zaobidejo mehanizme za rezistenco na stare antibiotike. K rezistenci na kinolone pripomore več različnih genov, najpogostejša pa je mutacija v tarčnih encimih, ki preprečuje povezavo ketokisline C3/C4 kinolona na encim preko mostička iz vode in iona. Trenutno potekajo raziskave na kvinatolindionih, kinolonom podobnim spojinah, ki zaradi odsotnosti ketokisline ne koordinirajo magnezijevega iona, se pa kljub temu vežejo na encim. Vendar pa je zaradi odsotnosti te povezave afiniteta kvinazolindionov do encima manjša kot pri kinolonih, poleg tega je zaradi odsotnosti ketokisline zmanjšana specifičnost spojine za bakterijske encime v primerjavi s človeškimi topoizomerazami tipa II. Za razvoj antibiotika bi morali najti spojino s substituentom na C7, ki bi stabiliziral povezavo z encimom, hkrati pa omogočil specifičnost antibiotika. Zanimivo možnost predstavlja tudi nibomicin, naravni antibiotik, ki deluje specifično na girazo ali topoizomerazo IV z mutacijo Ser→Leu v vezavnem žepu za kinolon, ki je najpogostejša mutacija v tarčnih encimih. Uporaba takega antibiotika bi bila učinkovita za zdravljenje okužb s sevi, odpornimi proti kinolonom, hkrati pa bi zmanjšala selekcijski pritisk za nastajanje novih sevov z mutiranimi encimi

Viri

Aldred, K. J., Kerns, R. J. and Osheroff, N. (2014) ‘Mechanism of quinolone action and resistance.’, Biochemistry. American Chemical Society, 53(10), pp. 1565–74. doi: 10.1021/bi5000564.

Keren, I., Wu, Y., Inocencio, J., Mulcahy, L. R. and Lewis, K. (2013) ‘Killing by Bactericidal Antibiotics Does Not Depend on Reactive Oxygen Species’, Science, 339(6124), pp. 1213–1216. doi: 10.1126/science.1232688.

Kohanski, M. A., Dwyer, D. J. and Collins, J. J. (2010) ‘How antibiotics kill bacteria: from targets to networks.’, Nature reviews. Microbiology. NIH Public Access, 8(6), pp. 423–35. doi: 10.1038/nrmicro2333.

Wiles, J. A., Bradbury, B. J. and Pucci, M. J. (2010) ‘New quinolone antibiotics: a survey of the literature from 2005 to 2010’, Expert Opinion on Therapeutic Patents, 20(10), pp. 1295–1319. doi: 10.1517/13543776.2010.505922.

Jacoby, G. A., Strahilevitz, J., & Hooper, D. . (2014). ‘Plasmid-mediated quinolone resistancicrobiology Spectrum, 2(2), doi: 10.1128/microbiolspec.PLAS–0006–2013.