Pospešena in vivo evolucija

Uvod

Darwinova evolucija je zelo pomembna za razvoj in raznovrstnost organizmov, sama po sebi pa traja zelo dolgo, saj je večina mutacij neuspešnih. Vseeno pa so jo znanstveniki v tem projektu izkoristili za razvoj novih biomolekul. Cilj njihovega projekta je razvoj hitrejše, lažje in robustnejše in vivo evolucije. Tako so prišli do novega koncepta, kjer so združili in vivo in in silico evolucijo. Pri tem so zasnovali in uporabili inteligenten algoritem, ki s pred izborom primernih proteinov pripomore k lažji izvedbi in vivo evolucije. Podlaga izvedbo in vivo evolucije je PACE (phage-assisted continuous evolution). To metodo sta izumila Kevin Esvelt in David Liu Iz Harvarda leta 2011, temelji pa na posnemanju naravne evolucije v bioreaktorju (zaprt sistem), ki je pospešena in usmerjena z metodami replikacije, mutacije in selekcije. Sistem temelji na preživetju mutiranih fagov M13 v E.coli, ki nosijo zapis za gen ki nas zanima za nadaljnjo selekcijo. Gostiteljska E. coli je zasnovana tako, da sintetizira snovi, ki povečajo mutacije v fagih skozi njihovo replikacijo. Poleg tega ima gene, ki ustvarijo pogoje da preživijo le fagi z željenimi mutacijami in tako se nadzira izražanje željenega gena, do katerega želimo priti z usmerjeno evolucijo.

PREDCEL

PREDCEL (Phage RElated DIsContinuous EvoLution) je poenostavljen metoda PACE, ki znanstvenikom omogoča da enostavno izboljšajo različne proteine za več različnih aplikacij. Problemi metode PACE so kontaminacije, izpiranje fagov in statičnost metode. Pri poskusih, kjer želimo inducirati evolucijo s kemikalijami, pa želimo spreminjati okolje, ki bo primerno za evolucijo s kemikalijami in selekcijo sevov, kar pa z kontinuiranim tokom v bioreaktorju ne moremo doseči. PREDCEL metoda je tudi enostavna, saj za njeno izvedbo ne potrebujemo posebne opreme ali znanja. Ta metoda je serijska in ročna. Za delo je potrebno sterilno okolje, da ne pride do fagnih kontaminacij. Protokol za to metodo je dostopen na njihovi spletni strani, ključen del pa je postopek imenovan PREDCEL-ing, kjer ciklamo faze okužbe s fagi in preverjanje njihove prisotnosti.

Ključen korak v PACE je generiranje pomožnega plazmida (AP). Ta skrbi za izražanje genaIII v odvisnosti od evolucije proteina. Povezava med fitnesom proteina ki nas zanima in izražanjem genaIII določa uspešnost direktne evolucije, prav tako pa je prisotnost proteinaIII potrebna za tvorbo novih delov faga. Izražanje genaIII pa mora biti ravno pravšnja, da je fagov dovolj in da ne vpliva negativno na njihovo reprodukcijo, kar pa je glavni izziv metode PACE. To se da regulirati s spreminjanjem RBS in mesta ori. Tako so za pripravo AP plazmida pripravili 5 delov, za konstrukcijo po Gibsonu.

Programska oprema

Razvili so programsko opremo, ki olajša izgradnjo željenih razmer za usmerjeno evolucijo, ki so ga poimenovali AiGEM (Artificial Intelligence for Genetic Evolution Mimicking). Srce tega programja je DeeProtein, ki je nekakšna nevronska mreža cca 10 milionov proteinskih sekvenc, ki lahko na podlagi surovih podatkov o zaporedju proteina predvideva njegove funkcije (geni imajo ontološka genska zaporedja, ki dajejo funkcijo, program pa je povezan z Uniprot bazo podatkov). To pa je povezano z genskim algoritmom GAIA (the Genetic Artificial intelligence algorithm), ki uvede mutacije in na podlagi podatkov, dobljenih od DeeProtein mreže, postavi in vrednoti vrednosti fitnesa, primerne sekvence pa izbere glede na postavljen prag. Z razmnoževanjem celic poteka evolucija, zadaj pa stoji algoritem, ki se s cikli razmnoževanja ponavlja. Na koncu pa SafetyNet z intergacijo izbere in odstrani pogoje, ki bi evolucijo vodili v smer nastanka nevarnih ali škodljivih proteinskih sekvenc.

Integracijo DeeProtein z algoritmom GAIA so preverili z laboratorijskim poskusom tako da so sintetizirali 30 različno aktivnih mutant in primerjali njihovo aktivnost z izračunano. V teoretičnem delu poskusa so definirali mesta, kamor bodo uvedli mutacije. To so naredili s pyMOL-om, tako da so sklepali glede AK ostankov. Nato pa so izbrali tiste, ki tvorijo žepe in so odgovorne za beta-laktamazno aktivnost. Za vsako okno so določili najbolj primerne spremembe, ki jih je uvedel GAIA – testiral do 1000 generacij z uvedbo ene zamenjave na generacijo. Pri vsaki generaciji so shranili 5 najuspešnejših in nato so za vsa mesta to skombinirali, sestavili in naredili oceno bolj in manj uspešnih od divjega tipa. V laboratorijskem poskusu so ustvarili biokocko, tako da so gen za beta-laktamazo vstavili v plazmid pSC1C3. Dodali so odpornost na ampicilin in odstranili restrikcijsko mesto za BsaI. Pomembna je tudi druga kaseta za odpornost, saj preko nje izberemo konstrukte neglede na delovanje beta-laktamaze. Mutacije so uvedli s PCR in različnimi primer-ji, ki so jih naročili, vse pa so delali po Golden Gate standardu. MIC (minimalna inhibitorna koncentracija) se navadno uporablja za določitev toksičnost snovi, v tem primeru pa za določanje delovanja proteina. V LB gojišče z 100ug/ml kloroamfenikola so gojili celice 20 h do stacionarne faze. Nato so celice nanesli na ploščo z različnimi koncentracijami karbenicilina – od 10 – 1280ug/ml, ter inkubirali 8h, nato pa izmerili celično gostoto. Določili so vrednost 0,08 pri OD600, ki je ločila odporne bakterije od neodpornih. 13 od 37 testiranih variant ni rasla pod nobeno koncentracijo karbencilina in ni izražala beta-laktamazne aktivnosti. Od tega so bile večina dvojne in trojne mutante. Ugotovili so ključna mesta, ki vplivajo na aktivnost encima in kompenzacijo ene od mutacij. 12 mutant je uspevalo pri vseh koncentracijah antibiotika (od tega je bila polovica dvojnih in trojnih mutant), zato so nadgradili poskus z višjimi koncentracijami antibiotika – do 19,2 mg/l, kjer so se mutante še ločile med sabo – 5 jih je bilo uspešnejših, 2 pa sta celo rastli pri najvišji koncentraciji. Za primerjavo z DeeProtein vrednotenjem, so rast določene mutante pri določeni koncentraciji določili glede na OD600 in sicer pod vrednostjo 0,08 mutante niso rasle, nad to vrednostjo pa in tako določili MIC vrednosti. Nato so povprečili še podatke iz DeeProtein baze in jim predpisali vrednosti, iz tega pa narisali graf vrednosti računalniškega izračuna v odvisnosti od MIC vrednosti. Te vrednosti so korelirale z MIC s korelacijskim koeficientom 0,6, kar kaže na povezavo med eksperimentalnimi podatki in računalniško napovedjo. Tako so z eksperimentom našli 2 mesti, ki zelo poslabšata encimsko aktivnost in 2, ki jo izboljšata

Za demonstracijo de novo funkcionalnosti so iz beta-glukorinidaze z usmerjeno evolucijo dobili beta-galaktozidazo. Izbrali so 7 najuspešnejših potomcev in jih analizirali. Z metodo ravnotežja molekulske dinamike po Matsamuru so določili 3 mesta za mutacijo. Z metodo GAIA so dobili veliko mutant, za delo v laboratoriju pa so jih morali izbrati le nekaj. Omejitev te metode je bila tudi ta, da so morali izbrati mutacije, ki niso bistveno spremenile prvotne strukture GUS. Pomagali so si tudi z modeliranjem v pyMOL-u. Nato je sledilo delo v laboratoriju. Delali so po protokolu Matsamura. Na plazmid z GUS genom pod lac promotorjem in z His-tag zaporedjem so klonirali GAL zaporedje in ustvarili 7 različnih mutant GUS. Nato so izvedli transformacijo, kulturo gojili čez noč, nato pa redčili in gojili do OD600 0,6 - 0,8, kjer so dodali IPTG in gojili 20h na 25°C pri 220rpm. Nato so celice lizirali in očistili proteine z afinitetno kromatografijo in Ni-NTA, nato pa z dializo. Koncentracijo proteinov so določili s fotospektrometrom in po Bradford-u. Aktivnost GAL so določili z p-nitrofenil-galactopiranozidom (PNPG), ki je substrat za GAL, saj hidrolizira p-nitrofenilno skupino. Rumeno barvo produkta so zaznali pri 420 nm. Z različnimi koncentracijami substrata so po Michaelis-Menten določili kinetiko encima (nelinearna regresija). Encimsko aktivnost GAL je kazala mutacija GUS T509L, katero je na tem mestu uvrstil najvišje tudi GAIA.

Za validacijo PREDCEL metode so izvedli direktno evolucijo encimov s preusmerjanjem katalitske aktivnosti promiskuitetnega citokroma c proti naravno nezaželenim produktom. Pri tem so uporabili program MAWS 2.0, ki ga je ustvarila iGem ekipa Heidelberga 2015, ki omogoča in silico dizajniranje apatamerov in posledično ribostikal. S tem programom so dizajnirali ribostikalo, ki je detektiralo organoslilicijski produkt, sintetiziran in vitro z modificiranim citokromom c. Da so dobili ribostikalo, so prilegali in silico kemijsko strukturo željenega produkta naključno generiranim RNA sekvencam, to pa so nato vrednotili, glede na tvorbo H-vezi s produktom. Sekvenco ribostikala so naročili v obliki oligonukleotidov, nato pa je bila pomnožena z single-cycle Touch-Down PCR. S tem ko ribostikala zaznajo produkt, katerega oblika je odvisna od evolucije, uravnavajo selekcijski pritisk z nadzorom izražanja M13 gena III, ki je ključen za reprodukcijo fagov. Organosilicijske spojine niso prisotne v naravi, promiskuitetni encim, kot je citokrom C, pa se da modificirati (to so naredili s programskim orodjem AiGEM), da katalizira reakcijo tvorbe organosilicijske spojine, ki jo nato ribostikalo zazna. To so validirali v E coli gostiteljskih celicah za reporter pa so uporabili luciferazo. Po čeznočni inkubaciji so klone inokulirali v 5 ml LB gojišče z dodatkom klorofenikola, čez noč na plošči z 96 luknjicami, dodali substrat in 2 aktivatroja stikala v dveh različnih koncentracijah, ter merili absorbanco pri 460nm. Pri višji koncentraciji aktivatorja je bilo več produkta, tam je bila tudi višja A. Tisti encim, ki je bil najbolj uspešen je nanj vplivala pozitivna selekcija tako, da je v teh celicah prišlo do večjega izražanja gena III in obratno.

(Nastja Marondini)

Povzeto po projektu skupine iGEM Heidelberg, 2017