H2ydroGEM - Čista energija za prihodnost

“Climate change is intrinsically linked to public health, food and water security, migration, peace, and security. It is a moral issue. It is an issue of social justice, human rights and fundamental ethics. We have a profound responsibility to the fragile web of life on this Earth, and to this generation and those that will follow.” – Ban Ki Moon, generalni sekretar Organizacije združenih narodov

Povzeto po iGEM projektu skupine z Univerze Macquarie iz Sydneya.

Avtor: Jakob Rupert

Uvod

Ideja o vodiku kot glavnem energetskem viru absolutno ni nova. Prvič je idejo o t.i. vodikovi ekonomiji predstavil znani biolog J.B.S. Haldane na simpoziju v Cambridgu leta 1923, kasneje pa so jo priložnostno obudili iz pozabe ob raznih naftnih krizah, okoljskih katastrofah in podobnih priložnostih, ko je začelo postajati očitno, da zaloge fosilnih goriv vendarle niso neizčrpne. V teoriji vodik odlično deluje kot pogonsko sredstvo, saj ima v primerjavi z bencinom precej večji energijski potencial (120 MJ/kg proti 45,6 MJ/kg), prav tako ima vodikova gorivna celica 8 % boljši izkoristek kot motor z notranjim izgorevanjem. Vendar takšna gorivna celica lahko koristi le izjemno čisti vodik (99,999 %), prav tako vodika v čistem stanju na Zemlji skoraj ni. Letno ga vseeno pridobimo več kot 50 milijonov ton, vendar od tega 95 % iz fosilnih goriv (od tega 48 % iz zemeljskega plina, 30 % iz nafte ter 18 % iz premoga) , kar praktično izniči njegovo uporabno vrednost kot obnovljiv vir energije. Preostalih nekaj odstotkov ga pridobimo pri elektrolizi vode v postopku, ki je kar 3- do 10-krat dražji od pridobivanja iz fosilnih goriv. Ključ do uspeha je torej učinkovito in poceni pridobivanje čistega vodika in prav na tega vprašanja se loteva projekt skupine s sydneyske univerze Macquarie. Uspešno so transformirali bakterijo Escherichia coli s t.i. genskim klastrom za proizvodnjo vodika (HGPGC) in na ta način dosegli mikrobno pretvorbo glukoze v vodik. Projekt je dobil zlato medaljo in nagrado za najboljši projekt s področja energetike na iGEM 2017.

Sintezna pot vodika

Mikrobne hidrogenaze

E. coli je sama po sebi sposobna sinteze vodika, saj vsebuje enega od treh znanih naravnih tipov hidrogenaz in sicer t.i. [NiFe] hidrogenazo (Kim et al., 2010). Preostali sta še arhejska [Fe] hidrogenaza in [FeFe] hidrogenaza iz cianobakterij. Največja težava hidrogenaz je, da jih inhibira kisik, ki ga cianobakterije naravno proizvajajo. Skupina se je odločila rešiti težavo tako, da so zapis za hidrogenazo iz cianobakterije Chlamydomonas reinhardtii (Mulder et al., 2011) prenesli v bakterijo E. coli, ki je fakultativni anaerob, skupaj z zapisi za določene kofaktorje, ki sodelujejo pri delovanju encima. Ta katalizira enostavno reakcijo pretvorbe dveh protonov in dveh elektronov v molekulo dvoatomnega vodika; 2 H⁺ + 2 e^- → 2 H₂. Za delovanje torej poleg encima potrebujemo vir elektronov in protonov in njihove prenašalce.

C. reinhardtii kot kofaktorje in prenašalce elektronov za hidrogenazo (Hyd1) uporablja feredoksin (Fdx) in feredoksin-NADPH reduktazo (FNR) in sicer prek oksidacije NADPH s Fdx. Ta sistem so se odločili v celoti prenesti v E. coli, skupaj s tremi kofaktorji Hyd1 in sicer HydE, F in G, ki omogočajo delovanje encima prek pravilnega sestavljanja železosulfidne kletke, potrebne za katalizo reakcije.

Vir protonov je načeloma manj problematičen, saj je potreben samo močan reducent; v celici so najbolj znani NADH, NADPH in CytC. Ker NADPH direktno interagira s Fdx in na ta način že sodeluje v reakciji, so se odločili za to pot. Prav tako je NADPH mogoče pridobiti direktno iz glukoze po pentozafosfatni poti. Po fosforilaciji s heksokinazo se glukoza-6-fosfat direktno oksidira prek glukoza-6-fosfat dehidrogenaze, kjer tudi dobimo prvo molekulo NADPH od skupno dveh v oksidativnem delu te metabolne poti. Končen produkt oksidativnega dela, ribuloza-5-fosfat, vstopi v neoksidativni del, kjer se s transaldolazami in transketolazami pretvori nazaj v glukoze-6-fosfat, ki lahko ponovno vstopi v oksidativni del. NADPH nato reducira Fdx, ki deluje kot vir elektronov za Hyd1. Druga molekula NADPH se porabi kot vir protonov in krog se sklene.

Teoretični model delovanja

Na podlagi zgoraj opisanega mehanizma lahko predpostavimo naslednje reakcije:

Oksidativni del PPP:

6 glukoza-6-fosfat + 12 NADP⁺ + 6 H₂O → 6 riboza-5-fosfat + 12 NADPH + 6 CO₂

Neoksidativni del PPP (regeneracija glukoze-6-fosfata):

6 riboza-5-fosfat → 4 fruktoza-6-fosfat + 2 gliceraldehid-3-fosfat

4 fruktoza-6-fosfat + 2 gliceraldehid-3-fosfat + H₂O → 5 glukoza-6-fosfat + Pi

Celokupna reakcija je torej:

glukoza-6-fosfat + 12 NADP⁺ + 7 H₂O → 12 NADPH + 12 H⁺ + P_i + 6 CO₂

Teoretično lahko torej iz 1 mol glukoze dobimo 12 mol NADPH. Če upoštevamo še korak nastanka vodika ter molekulske mase, lahko predpostavimo masna razmerja pretvorbe; 1 g glukoze zadostuje za 0,134 g vodika oziroma 1,49 L plina pri standardnih pogojih. Vendar je to zgolj teoretični model, ki predpostavlja, da se vsa glukoza oziroma NADPH porabita zgolj za proizvodnjo vodika. Na podlagi tega so v skupini postavili hipotezo, da bo končni izkoristek najverjetneje precej manjši. Kot cilj so si zastavili razmerje vsaj 1:4 oziroma doseči primerljivo proizvodnjo vodika kot sama C. reinhardtii. Ta po poskusu Mus in sod. znaša približno 0,05 mL/h.

Sestavljanje komponent za proizvodnjo vodika V E.coli

Skupina je zapise za vse proteine naročila že pripravljene za sestavljanje po protokolu 3A. Zaporedja za proteine so vzeli iz C. reinhardtii in optimizirali kodone za izražanje v E. coli. Končni cilj je bil t.i. genski klaster za proizvodnjo vodika (HGPGC), ki je vseboval vse funkcionalne komponente za proizvodnjo vodika na eni biokocki. Za ta namen so pripravili tri različne biokocke. BBa_S05396 je vsebovala zapisa za Fdx in FNR, vsakega s svojim RBS, pod kontrolo inducibilnega P_lac, dvojni terminator ter zapis za Hyd1 z lastnima P_lac in RBS. BBa_K2300000 je vsebovala zapisa za HydEF in HydG z lastnima P_lac in RBS ter dvojnim terminatorjem. Iz teh dveh biokock so pripravili HGPGC oziroma BBa_K2300001 ter z njim uspešno transformirali celice E. coli DH5α.

Testiranje in rezultati

Merjenje H₂ s Clarkovo elektrodo

Uspešno transformirane celice so gojili v mediju M9 do OD600 približno 0,5 ter nato inducirali izražanje z dodatkom IPTG do končne koncentracije 1 mM. Celice so gojili 24 h pri 37 °C in anaerobnih pogojih. Kulturo so nato redčili z medijem M9 z dodanim 1 mM IPTG in 20 mM glukozo do OD600 0,4 do končnega volumna 2 mL v zračno izolirani komori ter merili količino proizvedenega vodika s Clarkovo elektrodo. Ta se uprablja za merjenje koncentracije kisika v raztopinah (reakcija O₂ + 4 e^- + 4 H⁺ → 2 H₂O), vendar lahko pri 600 mV, anaerobnih pogojih in obrnjeni polariteti elektrod meri tudi koncentracijo vodika v raztopini (reakcija H₂ → 2 H⁺ + 2 e^-). Za referečno elektrodo so uporabili standardno kalomelsko.

Koncentracijo vodika so merili pri štirih različnih vzorcih in sicer:

• - inducirani netransformirani kulturi E. coli DH5α kot negativni kontroli: 0,0072 mM H₂/h; 0,32 µL/h;
  
• - inducirani kulturi, transformirani z BBa_S05396 (Fdx, FNR, Hyd1): 0,012 mM H₂/h; 0,52 µL/h;
  
• - neinducirani kulturi, transformirani z BBa_K2300001 (HGPGC): 0,026 mM H₂/h; 1,2 µL/h;
  
• - inducirani kulturi, transformirani z BBa_K2300001 (HGPGC): 0,11 mM H₂/h; 4,7 µL/h;
  
  

Koncentracija vodika je narasla pri vseh kulturah. E. coli divjega tipa namreč prav tako vsebuje [Fe] hidrogenazo, oba transgena seva pa hidrogenazo C. reinhardtii. Neinducirano kulturo so predhodno inducirali in gojili čez noč, tako da so se proteini izražali kljub temu, da v meritveno komoro niso dodali medija z IPTG. Meritve vseeno niso bile najbolj reprezentativne, saj Clarkova elektroda porablja vodik v raztopini in tako ustvarja tok. Meritve razpada vodika so nato dale končno proizvodnjo vodika v kulturi.

Merjenje in izolacija H₂

Samo proizvodnjo plina so nato izvedli v večjem merilu in sicer so uporabili 80 mL Büchnerjevo časo z inducirano kulturo transformant (OD600 0,2) v mediju M9 z 1 mM IPTG in 20 mM glukozo. Čašo so prek cevke povezali z obrnjenim valjev v čaši z vodo in celoten sistem hermetično zaprli, tako da je nastajajoč plin lahko izpodrinil vodo v valju. Celoten sistem je bil umerjen tako, da je bilo na začetku v sistemu približno 90 mL zraka, nato pa so ob rednih intervalih s siringo odvzeli vzorec plina in ga analizirali. Pri celičnem dihanju se porablja kisik in sprošča CO₂. Slednjega so odstranili po dodatku barijevega hidroksida, ko izpade netopen barijev karbonat. Po predvidevanjih sta nato ostala samo še dušik in vodik, njuno razmerje pa so določili s tehtanjem vzorca ter primerljivega volumna zraka in čistega vodika. Razmerje dušik:kisik v zraku je približno 80:20, zato bi ob popolni porabi kisika pričakovali ista razmerja za dušik in vodik. Vendar so v vzorcu izmerili 92 % dušika in 7 % vodika, kar pomeni, da je sistem očitno nekje puščal.

Rezultati

Proizvodnja vodika (Clarkova elektroda): 2,37 mL H₂/h
Proizvodnja vodika (Izolacija plinov): 7 mL H₂/h
Mus in sod. (C. reinhardtii): 4 mL H₂/h

Uporabnost sistema

Študenti so si sistem zamislili kot celico za proizvodnjo vodika v domači garaži, ki bi proizvajala vodik za avtomobil, ki ga poganja vodikova gorivna celica. Sistem bi bil narejen iz recikliranega jekla in vseboval fermentor s transgenim sevom E. coli, transformiranim s celotnim HGPGC. Vanj bi prek posebnih ventilov, ki bi preprečili morebiten pobeg GSO, dodajali tekoče gojišče, vodo ter glukozo. Vodik bi nato stisnili v cisterni pod pritiskom in z njim napolnili avto po potrebi. Presežek plina bi se shranjeval v posebnih celicah kot aluminijev trihidrid in se aktiviral po potrebi. Za izdelek, ki so ga poimenovali H2GEM, je skupina opravila tudi tržno raziskavo, identificirala ciljno skupino potrošnikov in razvila ustrezno tržno strategijo.

Zaključek

Cilj projekta je bil uspešno sestaviti biokocko, ki vključuje vse elemente za proizvodnjo vodika iz cianobakterije C. reinhardtii, z njo uspešno transformirati celice E. coli DH5α ter proizvesti vodik. Želja je bila doseči teoretično masno razmerjev pretvorbe glukoze v vodik v razmerju 1:4, vendar je žal ostal nedosegljiv. Projekt je bil tudi marketinško usmerjen v proizvodnjo celice za pridobivanje vodika v domači garaži kot goriva za avtomobil na vodikov pogon, vendar za izvedbo česa takšnega ekipa seveda ni imela sredstev. Dejstvo je, da živimo v vse bolj polariziranem svetu, ki čedalje bolj drsi v ekstreme. Demografski, kot so nezadržno naraščanje neenakosti, eksplozija prebivalstva; okoljski, kot je globalno segrevanje; ekonomski, kot je nepremišljeno pehanje za fiktivnimi neoliberalnimi načeli nenehne gospodarske rasti in hkratnim upadanjen naravnih virov; vsi so neogibno povezani med seboj. V tem kontekstu je projekt vsekakor smer, v kateri je potrebno delovati v prihodnje, torej poceni, nezahteven in tehnološko napreden način pridobivanja energetskih virov iz obnovljivih virov, ki upravičuje besede: "Znanost je čarovnija, ki deluje" iz romana Mačja zibka ameriškega pisatelja Kurta Vonnneguta.

Viri

Mus, F., Dubini, A., Seibert, M., Posewitz, M.C. and Grossman, A.R., 2007. Anaerobic acclimation in Chlamydomonas reinhardtii anoxic gene expression, hydrogenase induction, and metabolic pathways. Journal of Biological Chemistry 2007, let. 282, str. 25475 - 25486.

Mulder, D. W., Shepard, E. M., Meuser, J. E., Joshi, N., King, P. W., Posewitz, M. C., Broderick, J. B. & Peters, J. W. 2011. Insights into [FeFe]-hydrogenase structure, mechanism, and maturation. Structure 2011, let. 19, str. 1038 - 1052.

Kim Jaoon, Y., Jo, B. & Cha, H. Production of biohydrogen by recombinant expression of [NiFe]-hydrogenase 1 in Escherichia coli. Microbial Cell Factories 2010, let. 9, str. 54

Wiki stran ekipe iGEM 2017