Talk:Seminarji SB 2017/18

UPORABA ŠUMA V DIZAJNU GENSKIH STIKAL IN AMPLIFIKACIJI TRANKRIPCIJE

Uvod Regulirana ekspresija genov je process, s katerim celica nadzira proizvodnjo encimov in strukturnih proteinov v času. Velik delež regulacije poteka na ravni transkripcije. Regulacija poteka tako znotraj sistema kot tudi od zunaj – vpliv okolja. Najbolj splošen teoretični model za prikaz genske regulacije so regulacijske mreže biokemijskih reakcij. V eni izmed takih mrež so najdemo posamezne reakcije kot tudi njihove interakcije preko sistema. Prednost mrež je njihova celovitost (prikaz nihanja koncentracij reaktivnih spojin kot posledica interakcij med biokemijskimi reakcijami – notranja nihanja), čeprav jim primanjkuje analitične sledljivosti. Kvalitativna analiza je z napredkom tehnologije močno napredovala, kvalitativna analiza pa je po drugi strani zahtevna predvsem zaradi kompleksnosti sistemov. Zato moramo za analizo izbirati majne sisteme z majhnim številom faktorjev. Za razlago nihanj koncentracij spojin znotraj sistema se uporabljajo enačbe kemijske kinetike (zunanja nihanja pri tem zanemarimo). Te diferencialne enačbe podajajo spreminjanje koncentracije reakcijske spojine s časom v setu biokemijskih reakcij. Splošno prisotni so sistemi povratnih zank, ki povzročijo odklon kinetičnih reakcij od linearnosti. Šum v obliki naključnih nihanj v koncentracijskih vrednostih se pojavi v eni od dveh oblik. Prvi je notranji šum in njegova velikost je sorazmerna velikosti sistema. Ponavadi je termičnega izvora. Drugi je zunanji šum in izvira iz naključnih speminjanj enega ali več zunanjih kontrolnih parametrov (npr. kinetične konstante ločenega seta biokemijskih reakcij). Če je šum majhen, ga lahko v kinetičnih enačbah upoštevamo post hoc. Notranji šum upoštevamo, da izboljšamo približke naših enačb, medtem ko želimo pri zunanjem šumu predstaviti fenomen, pri katerem ne poznamo točnih detajlov. Šum podajamo aditivno, ko ga lahko uporabimo za proteinsko stikalo, ali multiplikativno, kjer majhne razlike v hitrosti transkripcije močno vplivajo na produkcijo proteina (poskus amplifikacije).

Model za ekspresijo represorja V kontekstu cikla lize-lizogenosti bakteriofaga λ je avtoregulacija represorja λ dobro karakterizirana. Kot modelni sistem za določitev kinetike transkripcije uporabimo plazmid bakteriofaga λ s promotorjem Pr-Pm in komponentami, potrebnimi za transkripcijo, translacijo in degradacijo. V divjem tipu je promotor sestavljen iz treh operatorjev, medtem ko za določitev kinetike transkripcije zaradi manjše kompleksnosti uporabimo mutanto z le dvema operatorjema (OR2 in OR3, OR1 izpustimo). Gen cl izrazi represor CI, ki dimerizira in z vezavo na DNA deluje kot transkripcijski faktor. V mutiranem sevu se veže na OR2 in OR3. Vezava na OR2 poveča hitrost transkripcije, medtem ko jo vezava na OR3 zmanjša. Nespecifično vezavo zanemarimo.   Kemijska kinetika Kemijske reakcije razdelimo na hitre (reda sekund) in počasne (reda minut). Med hitre prištevamo reakcije dimerizacije in vezave dimera na DNA. Hitrostne konstante so glede na zaporedno številko reakcije K1, K2, K3 in K4. K3 in K4 zaradi prikladnosti zapišemo relativno na K2 kot K3 = δ1K2 in K4 = δ2K2. Med počasni reakciji se štejeta transkripcija in degradacija. Obravnava se ju kot ireverzibilni reakciji. Hitrostni konstanti sta Kt in Kd. V in vitro sistemu z veliko stopnjo pretvorbe lahko zapišemo koncentracije reaktivnihi spojin kot dinamične spremenljivke, tako da je x = [X], y = [X2] D = [D], u = [DX2], v = [DX2*], z = [DX2X2] Izrazimo povprečni x (ob predpostavki, da je koncentracija RNA polimeraze (p0) konstantna) in se z izpostavljanjem znebimo znebimo y, u in d. Konstantno je tudi število promotorskih mest. Uvedemo dve novi spremenljivki, α in γ. α = nktp0dT/r in je pokazatelj relativnega povišanja transkripcije zaradi vezave represorja γ = kd/(r(K1K2)1/2) in je proporcionalen relativni močem razgradnje X in osnovnih vrednosti transkripcije.

Grafični prikaz Za mutiranega faga velja: δ1 ~ 1, δ2 ~ 5. Opazimo, da se enačba obnaša na dva načina. En set začetnih parametrov privede v monostabilnost – vse začetne koncentracije se razvijejo v enako vrednost – medtem ko drugi set parametrov privede do bistabilnosti – glede na začetne koncentracije pridemo do treh različnih vrednosti, vendar srednja vrednost ni stabilna. Do pojava bistabilnosti pride zaradi tekmovalnostjo med nastajanjem X in njegovo dimerizacijo ter razgradnjo. Bistabilnost se da prikazati grafično pri različnih vrednostih γ in ko je povprečni x = 0, α pa je konstantna (konstantna stopnja translacije in konstantno število vezavnih mest). Vidimo, da pri majhnih γ (ko je razgradnja v primerjavi z nastajanjem majhna) obstaja le ena možna vrednost x (in CI). Ko γ povečamo nad neko kritično vrednost γL, se pojavijo tri možne vrednosti. Ob še večjem povečanju γ nad γU, ko koncentracija x spet močno pade, pa se sistemu spet povrne monostabilnost. Parameter γ je torej kontrola, ki jo lahko v sistemu reguliramo. Potrditev dobimo tudi z risanjem grafa koncentracije CI v odvisnosti od γ). Če začnemo pri nizki vrednosti γ (npr. 5) in jo višamo, vidimo, da CI počasi pada. Ko γ preseže γU, koncentracija nemudoma skoči na močno nižjo vrednost. Če začnemo z visoko vrednostjo γ in jo postopoma znižujemo, se dogaja ravno obratno, ko pa se spoustimo pod vrednost γL, koncentracija nemudoma močno naraste, seveda pa se to zgodi ob drugačni vrednosti γ.

  Aditivni šum Kinetične enačbe so po izvoru kinetične, zato vpliv šuma obravnavamo statistično. Vpliv je majhen in ga lahko obravnavamo kot naključna motnja. Imel bo vpliv na hitrost bazne transkripcije, majhna nihanja v hitrosti bazne transkripcije pa se prevedejo v velika nihanja v hitrosti transkripcije represorja. Aditivni šum v enačbo vključimo linearno. Osnovne enačbe popravimo na nivoju hitrostnih konstant oz δ. Če narišemo graf Φ (integral desne strani osnovne enačbe) v odvisnosti od koncentracije CI, dobimo tako imenovani energijski teren (graf 2), ki je dobil svoje ime, saj ga lahko interpretiramo tudi kot spreminjanje potencialne energije nekega delca, ki potuje po tem terenu (miselni konstrukt, ključen za razvoj verjetnostnih enačb). Stabilna vrednost koncentracije represorja se nahaja v obeh minimumu grafa. Aditivni šum povzroči naključne poraste energije delca. Serija porastov energije lahko povzroči preskok delca iz enega v drug lokalni minimum. Da rešimo enačbo zazdnjo diferencialno enačbo, uvedemo porazdelitev verjetnosti – verjetnost, da najdemo sistem ob času t s koncentracijo x. Enačbo tako preoblikujemo v Fokker-Planckovo enačbo (parcialna diferencialna enačba, ki opisuje spreminjanje gostote verjetnostne funkcije hitrosti delca pod vplivom naključnih sil s časom – zato smo potrebovali energijski teren in miselni konstrukt v obliki delca). Zanima nas ssm koncentracija (vsota kvadratov koncentracij modela), zato enačbo rešimo pri distribuciji v stabilni fazi. Opazimo, da manjši šum povzroči porazdelitev verjetnosti okoli nižje koncentracije represorja, medtem ko večji šum povzroči porazdelitev verjetnosti okoli obeh koncentracij represorja. Rezultat se ujema s konceptualno obliko pokrajine. Majhen šum lahko povzroči le prehod iz višjega v nižje stanje, medtem ko velik šum pričakovano povzroči širšo porazdelitev in omogoči prehod v katerokoli smer. Model stikala Aditivni šum lahko uporabimo pri dizajnu proteinskih stikal. Če začnemo na ‘’OFF’’, ko je šum zelo majhen, imamo veliko populacijo verjetnosti pri nizkih koncentracijah. Ko skozi sistem spustimo kratek pulz močnega šuma, bo sistem zavzel konformacijo ‘’ON’’. Na ‘’OFF’’ se ne bo vrnil, saj bo povrnjen začetni majhen šum., prenizek, da bi sistem prešel kakršnokoli bariero. Da sistem povrnemo nazaj na ‘’OFF’’, bo potreben pulz srednje močnega šuma, dovolj velikega, za povrnitev v prvotno stanje, vendar dovolj majhen, da se sistem ne more vrniti v ‘’ON’’ stanje.

Multiplikativen šum Tokrat predpostavljamo, da α ni konstantna. Prek serij enačb, kjer predpostavimo, da parameter α niha naključno, ponovno vidimo, da izbrani parametri privedejo do monostabilnosti ali bistabilnosti. S podobnimi predpostavkami kot pri snovanju enačb za aditivni šum lahko ponovno zapišemo Fokker-Planckovo enačbo, ki jo lahko rešimo in narišemo ‘’terenski’’ graf.

  Zaključek Čeprav je delo osnovano na lastnostih bakteriofaga λ in represorja λ, lahko rezultate posplošimo na vse pozitivne regulatorne elemente. Ključna pri takšnem modelu je bistabilnost. Ugotavljajo, da se jo lahko doseže tudi pri sistemih, ki niso bistabilni, in sicer z električnim poljem, pa tudi s pH koontrolo, DNA titracijo ali z uporabo represorskih proteinov, odvisnih od temperature. Predvsem ima tehnologija potencial v genskih terapijah za kreiranje učinkovin, ki bi delovala periodično ali šele, ko dosežejo želeno mesto.

Vir: Jeff Hasty, Joel Pradines, Milos Dolnik, and J. J. Collins. ‘’Noise-based switches and amplifiers for gene expression.’’ PNAS 2000. 97, 5. 2075-2080.