VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z Vibrio natriegens

Uvod

VIBRIGENS je projekt študentske ekipe iz Marburga, ki so na tekmovanju iGEM 2018 osvojili glavno nagrado. Projekt je osnovan na ideji uporabe hitro rastoče bakterije Vibrio natriegens za procese molekulskega kloniranja, izražanja proteinov ter študije interakcij. Predstavili pa so tudi njeno uporabo za produkcijo 3-hidroksipropionske kisline <ref name="prvi">iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg</ref>.

Vibrio natriegens

Govorimo o nepatogeni halofilni gram-negativni bakteriji izolirani iz močvirskih področij, ki je postala zanimiva za biotehnološko uporabo zaradi njene hitrosti rasti <ref name="drugi"> Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens </ref>. V. natriegens ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne E. coli ter tako postati naslednji univerzalno aplikativen organizem v molekularni biologiji in biotehnologiji. Podvajalni čas pri optimalnih pogojih pri E. coli je 17 minut <ref name="tretji">Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.</ref> , medtem ko se populacija V. natriegens podvoji v samo 7 minutah <ref name="prvi" />.

Možnih razlogov za tako hitro rast je več. V. natriegens ima genom razdeljen na dva kromosoma, kar omogoča hitrejše podvojevanje DNA. Dokazana je bila tudi pristonost večjega števila ribosomov v celici v primerjavi z E. coli, kar povzroči hitrejše pridobivanje biomase. Mnoge komercialno zanimive spojine se zato že proizvajajo z uporabo V. natriegens. Primer je proizvodnja alanina, kjer so samo 4 delecije v sevu omogočile od 9-13 krat večjo produkcijo v primerjavi s specializirami sevi E. coli in C. glutamicum.

Za V. natriegens je značilna naravna kompetenca - sposobnost sprejemanja DNA iz okolja, ki jo regulira Tfox. TfoX je značilen za številne bakterije roda Vibrio, omogoča pa sprejemanje in genomsko integracijo DNA delcev preko homologne rekombinacije. Za razliko od večine ostalih bakterij iz roda, pa pri V. natriegens Tfox ni induciran v prisotnosti hitina, temveč je vzrok induciranja neznan. Zato je za uspešno delovanje sistema bilo potrebno TfoX postaviti pod kontrolo inducibilnega promotorja (npr. IPTG) <ref name="prvi" />.

Leta 2017 so raziskovalci za V. natriegens predstavili metodo MuGENT (angl. »multiplex genome editing by natural transformation«) <ref name="četrti">T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017</ref>, ki omogoča urejanje genoma na več mestih hkrati z uporabo le enega zapisa za rezistenco na antibiotik. Pri uporabi metode predpostavljamo, da ob induciranju kompetence, obstaja znotraj populacije le manjša skupina bakterij, ki je sposobna sprejeti DNA verigo, hkrati pa lahko te bakterije sprejemajo in integrirajo več verig DNA hkrati. Celice v procesu inkubiramo z linearno selektivno DNA, ki v genom uvede rezistenco na antibiotik, ter neselektivno DNA, ki uvaja izbrane genomske spremembe na enem ali več lokusih <ref name="prvi" />.

Zbirka Marburg

Čeprav so v raziskavi Weinstock et al. 2016 <ref name="peti">M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.</ref> pokazali, da lahko pri V. natriegens uporabljamo več komercialno dostopnih plazmidov, je ekipa iz Marburga pripravila zbirko plazmidov z več kot 120 osnovnimi genetskimi deli, ki omogočajo de novo sestavljanje plazmidov za uporabo v V. natriegens ter tudi kateri drugi bakteriji. Pri načrtovanju zbirke so se zgledovali po že znanih bakterijskih zbirkah, kot sta EcoFlex in PhytoBrick. Ti sta osnovani na metodi »golden gate« in omogočata sestavljanje posameznih transkripcijski enot ter njihovo združevanje na destinacijski plazmid.

Prednost zbirke Marburg je njena fleksibilnost. Zbirka omogoča povsem de novo sestavljanje plazmida namesto uporabe destinacijskih vektorjev, kot je to pri drugih zbirkah. Tako pri pripravi plazmida nismo omejeni na ORI-mesto in zapis za rezistenco na antibiotik, ki se nahajata na destinacijskem vektorju, temveč lahko pripravimo celoten plazmid kompatibilen tarčnemu organizmu. Najosnovnejši genetski deli so shranjeni na plazmidih ničte ravni in omogočajo združevanje v transkripcijko enoto, kar privede do plazmida prve ravni. Uporaba plazmidov prve ravni pa omogoča pripravo multigenskega konstrukta – plazmida druge ravni, ki vsebuje več transkripcijskih enot <ref name="prvi" />.

Urejanje genoma – FLP/FRP

Zaradi naravne kompetence V. natriegens, ki omogoča sprejemanje proste DNA iz okolja, lahko na bakterijah izvedemo plazmidno neodvisno genomsko urejanje z linearnimi fragmenti DNA. Med fragmenti, ki jih želimo vključiti, je potreben vsaj en zapis za odpornost na antibiotik, s katerim opravimo selekcijo klonov, ki so uspešno vključili DNA fragmente. Da pa ostanejo sevi kompatibilni z vsemi plazmidi in njihovimi rezistentnimi markerji, je potrebno kasete z zapisom za odpornost načrtovati tako, da jih lahko po integraciji odstranimo.

Študentje so za hitro genomsko delecijo uporabili sistem za urejanje genoma iz kvasovke – FLP/FRT. Za vzpostavitev sistema v V. natriegens je bilo potrebno celicam predstaviti FLP rekombinazo ter genomska FRT zaporedja na mestih, ki jih želimo modificirati.

Najprej so pripravili zapis za odpornost na kloramfenikol, ki je na navzgor in navzdol v zaporedju vseboval FRT zaporedji v enaki orientaciji ter homologni regiji gena za dns nukleazo. Uspešno integracijo fragmenta so preverili z metodo PCR na osnovi ene kolonije.

Nato so v celice prenesli funkcionalno FLP rekombinazo. Plazmid z zapisom so pripravili z zbirko Marburg, ta pa je bil osnovan plazmidu pBR-FLP, ki je drugih raziskavah že pokazal učinkovito vzpostavljanje sistema FLP/FRT pri ostalih bakterijah roda Vibrio (V. cholerae). Rekombinaza je v celicah prepoznala FRT zaporedja v enaki orientaciji ter izrezala zapis za odpornost na antibiotik iz genoma <ref name="prvi" /><ref name="šesti">M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.</ref>.

Priprava sevov

V laboratorijih uporabljamo različne seve E. coli za metode kloniranja, proteinske ekspresije ali določanja proteinskih interakcij. Analogno so pri projektu Vibrigens pripravili 3 različne seve V. natriegens, ki so osnovani na genotipih pogosto uporabljenih E. coli sevov.

VibriClone

Pri zgledovanju po E. coli, so za ustrezen klonirni sev V. natriegens potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri V. natriegens sta Dns, ki je homologna EndA iz E. coli, in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature. Raziskovalci so že dokazali [5], da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.

Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.

Za omogočanje modro-belega testa so v genom vstavili tudi laktozni operon brez lacZ α podenote iz E.coli seva DH5α [1].

VibriExpress

Študentska ekipa je ekspresijski sev V. natriegens modelirala po sevu E. coli BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom V. natriegens ter delecije zapisov za proteazi Lon in OmpT. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo [1].

VibriInteract

Za razumevanje biokemijskih procesov nekega proteina, je poleg osnovne karakterizacije pomembno tudi poznavanje proteinskih interakcijskih partnerjev. Ekipa je pripravila tudi sev V. natriegens - VibriInteract, ki omogoča uporabo najhitreje rastoče bakterije za študije proteinskih interakcij. Prepoznavanje interakcijskih partnerjev temelji na dvohibridnem sistemu, ki ga pri kvasovkah in bakterijah že poznamo, vendar bo z uporabo V. natriegens celoten proces precej manj časovno potraten. Bakterijski dvohibridni sistem je osnovan na rekonstrukciji signalne poti, ki je odvisna od adenilat ciklaze (CyaA). CyaA je regulator v celicah kot so E. coli, kjer katalizira pretvorbo ATP v cAMP. cAMP pa s tvorbo kompleksa cAMP/CAP deluje kot pozitivni regulator mal in lac operona.

Pri pripravi seva je bilo potrebno izvesti genomsko delecijo gena cyA, ki kodira za katalitično domeno adenilat ciklaze. Izvedba eksperimenta nato poteka z uporabo komercialno dostopnih komplementarnih fragmentov T25 in T18 katalitične domene adenilat ciklaze. Fragmente v celici izražamo s fuzijskimi partnerji in v primeru, da pride do proteinske interakcije, bo prišlo do sinteze cAMP ter posledično bodo lahko celice porabljale maltozo in laktozo. Primerjali so VibriInteract z E. coli sevom BTH101, ki se navadno uporablja za študije interakcij, ter dokazali, da rast VibriInteracta veliko hitrejša [1].

Metabolni inžiniring

Zaradi velike genetske dostopnosti, hitre rasti in visoke absorpcije substratov V. natriegens, je študentska ekipa želela predstaviti tudi njeno primernost pri metabolnem inžiniringu. Želeli so pospešiti metabolizem s predstavitvijo poteka dela, ki omogoča hitro konstrukcijo metabolnih poti, pregledovanje produktov in optimizacijo procesa.

Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.

Kot biosenzorje so pripravili plazmide z zapisi za reporterske proteine (npr. GFP) ter transkripcijske faktorje, ki so odzivni na ustrezne metabolite. Plazmide so transformirali v celice, kar je omogočalo kvantitativno določanje količine ustreznega metabolita. Učinkovitost celotnega pristopa so tudi pokazali s kreacijo in optimizacijo sintezne poti 3-hidroksipropionske kisline [1].

Zaključek

Ekipi je uspelo predstaviti najhitreje rastočo bakterijo Vibrio Natriegens, kot šasijo, ki ima potencial izriniti večinsko uporabo trenutno dominantne E. coli. Pripravili so tri seve, ki predstavljajo izhodišče za specializacijo in uporabo pri metodah molekulskega kloniranja, proteinske ekspresije in določanja proteinskih interakcij. Zasnovali so osnoven pristop k metabolnem inžineringu V. Natriegens. Pripravili pa so tudi zbirko osnovnih genetskih gradnikov, ki omogoča hitro de novo sestavljanje plazmidov.

Viri

<references/>

[1] iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg

[2] Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens

[3] Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.

[4] T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017

[5] M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.

[6] M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.