Zaznavalni niz genetskih biopikslov sklopljenih preko radikalov

Izhodiščni članek: A. Prindle et.al. "A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’" Nature, 2011

---

Ozadje

Namen raziskovalcev je bil ustvariti biosenzor za arzen, ki izkorišča bakterijski naravni odzivni sistem na prisotnost arzenita (As3+) in koncept genetskega vezja, ki ta sistem povezuje z reporterskim proteinom na do sedaj nov način; to je preko merjenja frekvence nihanja ekspresije GFP, in ne preko same intenzitete fluorescence, kot je bilo narejeno že pred leti [1].

Ideja je bila ustvariti oscilirajoči senzor. Prednost oscilirajočih senzorjev je preprostost kvantizacije signala, tj. frekvence. V primeru klasičnih, neoscilirajočih senzorjev, pri katerih namesto frekvence merimo intenziteto optičnega signala, moramo vrednosti vedno znova normalizirati in kalibrirati, saj imajo eksperimentalni faktorji, kot je intenziteta vzbujajočega žarka in čas izpostavitve večji vpliv, prav tako nihajni čas ni odvisen od amplitude. Oscilirajoči senzorji so torej boljši za ponovljivost in preprostost meritev, kar prinaša svoje prednosti pri razvoju točnega komercialnega senzorja [2].

Fizična zasnova in gensko vezje

Fizično je biosenzor sestavljeni iz urejenega niza posameznih kolonij E. coli, ki so med seboj ločene s pregradami. Genetsko pa je zapis načrtovan, da je izražanje reporterja sfGFP:

1) pozitivno regulirano z arzenitom (posredno),

2) pospešeno s pomočjo pozitivnih povratnih zank v genskem vezju,

3) medcelično usklajeno na dveh nivojih.

Ta dva nivoja usklajevanja sta intrakolonijsko preko zaznavanja gostote (ang. »quorum sensing«) in interkolonijsko z reaktivnimi kisikovimi zvrstmi (ROS) in posledično plina H₂O₂, ki potuje med kolonijami in prodira v celice. Zaznavanje gostote je način regulacije ekspresije proteinov na podlagi gostote populacije celic, ker to pomeni boljši fenotip in izboljša preživetje – neke vrste bakterijski približek večceličnosti. Uporablja se za usklajevanje celic, a na dolge razdalje deluje precej počasi, zato so pri povečevanju obsega (ang. »scaling-up«) dodali usklajevanje preko hlapnega vodikovega peroksida. Oba nivoja sta nepogrešljiva za zagotovitev urejenih nihanj. [3].

Namesto da so izdelali oscilirajoči senzor iz ene ogromne kolonije (ki se usklajuje počasi, samo preko zaznavanja gostote), so zvezali tisoče malih oscilirajočih kolonij – biopikslov – v mikrofluidni niz. Znotraj kolonije se oscilacije usklajujejo preko zaznavanja gostote, med kolonijami pa deluje druga, hitrejša raven signalizacije. Le-ta vključuje H₂O₂ in E.coli lastno »redoks mašinerijo«. Obe vrste signalizacije oz. usklajevanja oscilacij delujeta sinergistično, a zelo različno: zaznavanje gostote je močna, a deluje na kratke razdalje (pod 1 mm), redoks pa je šibkejša, a zagotavlja daljši doseg. Za mikrofluidni niz velja analogno kot za letališča: ni možno (niti koristno), da bi bila vsa letališča med seboj povezana z leti. Leti z manjših letališč so lokalno povezani preko večjih letališč, ki imajo globalne povezave, ta globalna povezava pa v tej analogiji predstavlja redoks signalizacijo.

Konstrukcija genske platforme za ustvarjanje nihanj

Začeli so na intrakolonijskem nivoju, z uporabo t.i. avtoinduktorja (ang. »autoinducer«) Gram-negativnih bakterij AHL (N-acil homoserin lakton), ki difundira po mediju in deluje med celicami znotraj kolonije. AHL je bistven za zaznavanje gostote: produkt gena LuxI je AHL sintaza. Produkt gena AiiA (autoinducer inhibitor A) je posredni represor gena LuxI, saj deluje kot laktonaza in razgrajuje AHL [4]. AHL se poveže z LuxR in s tem ustavi utišanje genov LuxI, AiiA, sfGFP in Ndh, ki imajo lux promotorje. Povezava AHL z LuxR torej poveča ekspresijo sfGFP in pa samega LuxI – avtoinduktivna pozitivna povratna zanka omogoča pospešitev izražanja in sinhronost skupinskega vedenja. Na drugi strani pa prisotnost gena AiiA pod enakim promotorjem sistemu prinaša fino negativno regulacijo ter zaključitev nihajnega vrha in vrnitev v dno oscilacije. Gena LuxI in AiiA sta tako odgovorna za sinhronizirano nihanje AHL in s tem za oscilacije fluoresciranja biopiksla. Vpliv AHL med kolonijami ni možen, ker so le-te delno ločene, medij med njimi pa ima visok pretok [3], [5], [6].

Interkolonijska redoks signalizacija pa ne deluje s pomočjo molekul, ki difundirajo preko medija, kot je AHL, saj je edina povezava med posameznimi biopiksli preko zraka – uporabili so vodikov peroksid. To so dosegli, z vnosom kopije gena ndh (NADH dehidrogenaza II – NDH-2) pod kontrolo enakega lux promotorja, kot vsi ostali navedeni geni. Ndh je membranski encim in proizvaja H₂O₂ in superoksidni radikal O2-. Plinasti H₂O₂ potuje med kolonijami, prodira v celice in posredno aktivira lux promotorje; inaktivira ArcAB, ki je sicer del redoks kontrolnega sistema in se veže na lux promotorje ter jih utiša. Ob prisotnosti peroksida so torej lux geni aktivni. Tovrstna aktivacija omogoča dodatno pozitivno povratno zanko za sinhronizacijo populacije [3].

Ko je bil razvit ta sistem sinhronizacije nihanj v dveh nivojih, so ga poenostavili. Odstranili so gen ndh kot proizvajalec radikalov (ki nato tvorijo peroksid), to nalogo pa je prevzel sam GFP. Ob višku izražanja GFP-ja celice izpostavimo žarku fluorescentne svetlobe, kar povzroči nastanek radikalov in posledično peroksida; ob oscilatornem dnu pa GFP-ja praktično ni, kar pomeni da ob obsevanju ni tudi peroksida. GFP ima tako v poenostavljeni platformi dvojno vlogo: vlogo sklopitelja (generiranje radikalov za globalno sinhroniziranje) in vlogo reporterja [3].

Vpliv sprememb radikalov na nihalno gensko platformo

Naslednji korak raziskovalcev je bil preučiti vpliv okoljskih dejavnikov, ki bi lahko motili količino radikalov, potrebnih za interkolonijsko signalizacijo. Najprej je bil preučen vpliv katalaze in vpliv superoksid dizmutaze (SOD) na nepoenostavljeno platformo – ta, ki generira radikale z ndh. Prisotnost katalaze povzroči izgubo medkolonijske sinhronizacije, ne vpliva pa na oscilacije posameznih kolonij. To pomeni, da odtegnitev peroksida prepreči drugo raven signalizacije in razklopi biopiksle. Na drugi strani pa SOD povzroči izrazit usklajen val fluorescence, kateremu sledi konstanten signal brez oscilacij. Razlog za to je dejstvo, da SOD poveča delež superoksidnega radikala, ki se pretvori v H₂O₂. Preveč peroksida posledično onemogoči nihanja – pride do konstantne fluorescence. Do zelo velike koncentracije H₂O₂ pride kljub temu, da je SOD znotrajcelični encim – razlog za to je visoka katalitična aktivnost dizmutaze [3], [7].

Vpliv katalaze in SOD na poenostavljeno platformo je bil identičen kot pri tisti z genom ndh. To potrjuje pomembnost ravno prave količine H₂O₂, potrebne za usklajevanje biopikslov ter zagotavlja, da sprememba vira radikalov (GFP namesto NDH-2) ne okrni kvalitete radikalne signalizacije med kolonijami. Pri tej platformi so preučili tudi vpliv tiosečnine in ampicilina; tiosečnina je dušilec radikalov in rezultati so pokazali, da kot tak onesposobi sinhronizacijo nihanj, brez da bi škodil viabilnosti. Ampicilin, ki pa proizvaja radikale, prav tako poruši usklajenost nihanj (podobno kot pri SOD), kar pomeni, da prevelika količina radikalov tudi onemogoči sinhronizacijo [3].

Konstrukcije makroskopskega biosenzorja za arzenit

Naloge so se lotili na dva načina. Pri prvem se ob prisotnosti arzenita zgolj spremeni frekvenca nihanja fluorescence, pri drugem pa gre za »on-off« sistem, torej se sinhronizirano nihanje vzpostavi šele ob pražni vrednosti koncentracije arzenita [3].

Modulacija frekvence

Osnovni platformi so dodali še eno kopijo gena LuxI (gen za AHL sintazo), le da je ta pod kontrolo arzenit-odzivnega elementa (ArsRE). Ko arzenita ni v mediju, so prisotne bazalne oscilacije zaradi izražanja prvotne kopije LuxI kot posledica peroksida, saj je na arzenit-odzivni element vezan represor ArsR. Ko pa je arzenit prisoten, se poveže z represorjem ArsR, povzroči njegovo oddisociacijo z ArsRE in tako prepreči nadaljnjo represijo LuxI gena – torej zaradi arzenita se izraža dodaten LuxI, kar privede do povečane količine AHL in posledično do povečanega nihajnega časa in amplitude ter zmanjšane frekvence. Testiranje tega konstrukta pri različnih količinah arzenita je pokazalo, da se je nihajni čas sorazmerno povečeval s povečevanjem koncentracije arzenita. Izkazalo se je, da je tak senzor sposoben zaznati in tudi kvantificirati koncentracije arzenita že od 0,2 µM naprej, s tem da WHO direktiva določa zgornjo mejo sprejemljive koncentracije za države v razvoju pri 0,5 µM [3].

Vse ali nič

Nihanje se zgodi le ob doseganju pražne koncentracije (ang. »thresholding«). V DNA je bil vstavljen zapis za LuxR pod kontrolo arzenit-odzivnega elementa. Ta gen LuxR isto kot že pri osnovni platformi ni imel povezave s preostankom vezja, torej za razliko od ostalih genov platforme ni pod lux promotorjem; razlika je v tem, da se LuxR ne izraža več konstitutivno kot prej, ampak zgolj in samo inducibilno, in to s strani arzenita. To pomeni, da se v odsotnosti arzenita LuxR ne izraža, za aktivacijo gena LuxI pa je bistven kompleks LuxR-AHL – torej brez le-tega ni fluorescence in ni oscilacij. Ko pa arzenit je prisoten, se izrazi LuxR, zaradi njega in AHL pa tudi LuxI, kar obnovi funkcijo vezja in dobimo usklajeno nihanje. Ta sistem »vse ali nič« se vklopi pri 0,25 µM arzenitu, a to ni absolutna spodnja meja. Pražno koncentracijo se da še dodatno prilagoditi s spreminjanjem komponent genskega vezja (število kopij genov, Shine-Dalgarnovo zaporedje ipd.) [3].

Zaključek

Oba načina signalizacije sta bila uporabljena za »scale-up« tega biosenzorja, a je vseeno potrebna mikroskopija za detekcijo, kar je nepraktično za komercialno uporabo. Ustvarjeni senzor z globalno sinhronizacijo je niz velikosti 24 mm x 12 mm in vsebuje 12 000 biopikslov oz. kolonij, skupno okoli 50 milijonov celic. Kljub že sicer povečanem signalu, ga je potrebno še dodatno ojačati, da bi lahko postal senzor uporaben v vsakdanjem življenju. To bi lahko dosegli s spremembami niza, kot je število biopikslov in njihova razporeditev, kar privede do različnih »output« oscilacij [3].

Za perspektivo je mogoče smiselno omeniti alternative v detekciji arzena, oz. načine, katerim je ta novi biosenzor alternativa. Prva naprava za detekcijo arzenita vodi doda Zn, ta pa katalizira nastanek plina arzina AsH₃. Arzin reagira z detektorjem nad gladino, ki vsebuje HgBr (ali AgNO₃), in pride do rumenega (ali sivega) obarvanja. Drug način uporablja zlate nanodelce – aptameri so v kompleksu s surfaktanti, ki sicer omogočijo agregacijo zlatih nanodelcev; ko pa pride arzenit, se tvorijo As(III)-aptamer kompleksi, prosti surfaktanti pa sprožijo obarjanje zlata, kar vodi v obarvanje. Tretji način pa je že biosenzor – kolonija E. coli, ki imajo LacZ gen pod ArsRE, zaznavamo pa padec pH, ki je posledica razgradnje laktoze [1], [3], [8], [9].

Vidne prednosti te alternative so nedvoumnost detekcije (ne kot pri redukciji azenita v arzin), manj proizvedenih odpadkov in strupenih snovi (enkratna uporaba ostalih detektorjev, arzin, Hg) in potencialna cenovna konkurenčnost. Predvidena cena konceptualne naprave z biosenzorjem je pod 50$, najpomembneje pa je, da ni za enkratno uporabo kot so trenutni senzorji [1], [3], [8], [9].

Viri

[1] N. Joshi, X. Wang, L. Montgomery, A. Elfick, and C. E. French, “Novel approaches to biosensors for detection of arsenic in drinking water,” Desalination, vol. 248, no. 1–3, pp. 517–523, 2009.

[2] T. Gast, “Sensors with oscillating elements,” J. Phys. E., vol. 18, no. 9, pp. 783–789, 1985.

[3] A. Prindle, P. Samayoa, I. Razinkov, T. Danino, L. S. Tsimring, and J. Hasty, “A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels,’” Nature, vol. 481, no. 7379, pp. 39–44, 2012.

[4] and L.-H. Z. Yi-Hu Dong, Jin-Ling Xu, Xian-Zhen Li, “AiiA, an enzyme that inactivates the acylhomoserine lactone quorum-sensing signal and attenuates the virulence of Erwinia carotovora,” Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 97, no. 7, pp. 3526–3531, 2000.

[5] “Quorum sensing 101: https://sites.tufts.edu/quorumsensing/quorumsensing101/,” citirano dne 6.1.2019.

[6] T. Chu et al., “In vivo programmed gene expression based on artificial quorum networks,” Appl. Environ. Microbiol., vol. 81, no. 15, pp. 4984–4992, 2015.

[7] M. Balamurugan et al., “Recent trends in electrochemical biosensors of superoxide dismutases,” Biosensors and Bioelectronics, vol. 116. pp. 89–99, 2018.

[8] “Low cost open source arsenic detector: https://www.kickstarter.com/projects/1499966707/low-cost-open-source-arsenic-detector-for-drinking?ref=category,” citirano dne 6.1.2019.

[9] J. Das, P. Sarkar, J. Panda, and P. Pal, “Low-cost field test kits for arsenic detection in water,” J. Environ. Sci. Heal. - Part A Toxic/Hazardous Subst. Environ. Eng., vol. 49, no. 1, pp. 108–115, 2014.