Razodetje povezovalnega kompleksa med endoplazemskim retikulumom in mitohondrijem s presejalnim testom sintezne biologije

Uvod

S pomočjo umetnega proteinskega konstrukta, ki lahko funkcijsko nadomesti naravno prisoten protein v celici, lahko zelo natančno določimo sestavo slednjega. V tem primeru je bila na ta način razkrita povezava med mitohondrijem in endoplazemskim retikulumom.

Sodelovanje med organeli

Evkariontske celice so tekom evolucije preko kompartmentalizacije razdelile funkcije na posemezne organele. To je po eni strani zelo učinkovito zaradi prilagojenega kemijskega okolja, vendar je prav tako med temi organeli nujna komunikacija in izmenjava raznovrstnih molekul. Kot primer, fosfolipidi so sintetizirani v endoplazemskem retikulumu, ki se nato razvaža po celici s pomočjo vezikularnega transporta, v katerega pa mitohondrij ni vključen <ref name="prvi"> Kornmann, Benoît et al. “An ER-mitochondria tethering complex revealed by a synthetic biology screen” Science (New York, N.Y.) vol. 325,5939 (2009): 477-81 </ref>.

Študije so pokazale, da transport prej omenjenih fosfolipidov in prav tako kalcijevih ionov med endoplazemskim retikulumom in mitohondrijem poteka na točkah, kjer prihaja do stika med dvema organeloma. Ti »stiki« bi lahko bili ključni za nadzor citosolne in mitohondrijske koncentracije kalcijevih ionov. Z njimi povezujejo tudi proteini IP3 receptor (Ca2+ kanalček), VDAC (mitohondrijski od napetosti odvisen anionski kanalček), šaperona grp75 in σ1R, sortirni protein PACS-2 in mitofuzin Mfn2 <ref name="prvi"> </ref>.

Chimera

V tej raziskavi so uporabljali sev Saccharomyces cerevisiae. Ideja je bila, da bi vzeli mutante tega seva, ki imajo okvarjeno povezavo med organeloma, kar bi povzročilo opazne posledice v celici, vendar bi jih lahko preprečili z uporabo umetnega proteina, ki bi nadomestil njegovo funkcijo. Ustvarili si umetni protein, ki so ga poimenovali ChiMERA – »construct for helping in mitochondria-ER associaton«. Sestavljen je bil iz N-končne mitohondrijske signalne sekvence, transmembranske domene izpeljane iz protein Tom70, centralnega modula iz GFP proteina in C-končnega ER repnega sidra izpeljanega iz Ubc6 <ref name="prvi"> </ref>.

Mitohondrij lahko zavzema sferično obliko podobno fižolu, ali pa celo razvejano tubularno omrežje. V primeru S. cerevisiae je mitohondrij v celicah divjega tipa (wt) razvejan v bližini membrane. Takšna oblika se vzdržuje s pomočjo fizije in fuzije ki se dogaja napribližno vsaki dve minuti <ref name="drugi"> Shaw, Janet M and Jodi Nunnari. “Mitochondrial dynamics and division in budding yeast” Trends in cell biology vol. 12,4 (2002): 178-84 </ref>. V tej raziskavi so sevi z mutiranimi in okvarjenimi geni, ki sodelujejo v povezavi ER-mitohondrij, izgubili takšno obliko.

Konstrukt ChiMERA se je v največji meri lokaliziral na membrano ER in je označil tako periferni kot perinuklearni ER, mitohondrij pa je označil le na mestih kontakta z ER. WT sevi so brez izražanja ChiMERE imeli mitohondrij prej opisane tubularne mreže, izražanje konstrukta pa je dodalo nekaj točkastih struktur na mestih kontakta z ER. S tem so pokazali, da umetni povezovalec izvaja želeno funkcijo. Močnejšo afiniteto konstrukta do ER so razložili z večjo dominanco vezavnega zaporedja za ER v primerjavi z vezavnim zaporedjem za mitohondrij v konstruktu <ref name="prvi"> </ref>.

Identifikacija povezave ER-mitohondrij

Za izražanje konstrukta je bil uporabljen kvasovkin centromerni plazmid. Približno 100 000 kolonij je bilo tretiranih s etilmetansulfonatom (EMS) za mutacijo, izmed nastalih mutant pa so dobili dve, ki nista mogli rasti brez prisotnosti plazmida. S pomočjo genske komplementacije so ugotovili, da sta obe mutaciji prisotni na genu MDM12. Mdm12 je periferni protein zunanje mitohondrijske membrane, ki se ga da izolirati v kompleksu z Mmm1 in Mdm10. Lokalizira se v točkastih strukturah na mitohondrijskem omrežju še skupaj s četrtim proteinom, Mdm34. Vsi štirje proteini so nujni z aerobno rast in ohranjanje pravilne tubularne strukture mitohondrija <ref name="prvi"> </ref>.

V naslednji fazi so preverili v kolikšni meri izražanje ChiMERE kompenzira okvaro povzročeno z delecijo vsakega posameznega gena – MMM1, MDM10, MDM12 in MDM34. Na YP ploščah, ki omogočajo fermentacijo, je razlika v uspešnosti rasti slabo opazna, medtem ko je rast na respiracijskih ploščah YPEG zelo uspešno ob prisotnosti umetnega konstrukta pri delecijah genov pri sevih mdm12Δ in mdm34Δ . S pomočjo umetnega konstrukta jim je prav tako uspelo rešiti tubularno strukturo mitohondrija pri sevih mdm12Δ in mdm34Δ, kar se ujema z prejšnjimi rezultati aerobne rasti. Novoidentificirani kompleks Mmm1/Mdm10/Mdm12/Mdm34 so poimenovali ERMES. Predvidevali so, da nekatere komponente ERMES-a pripadajo ER, nekatere pa mitohondriju. Mutacija v katerikoli komponenti je usodna za stik. Kadar se stik prekine, te ostanejo zasidrane v matični organel <ref name="prvi"> </ref>.

Študije kompleksa ERMES

Najprej so zamenjali gen za vsako komponento ERMES-a z genom za fuzijski protein z GFP. Tako so imeli seve MMM1-GFP, MDM12-GFP, MDM34-GFP in MDM10-GFP. Nato so s fluorescenčno mikroskopijo opazovali WT in mutirane seve, kjer so mutirali vsako komponento ERMES-a posebej tako, da ni bila več funkcionalna.

• Vsi WT izhodni štirje sevi z zapisi za fuzijski protein so izkazovali točkaste strukture (sklepali na stike ER-mitohondrij), razen MDM10-GFP, kjer so signali bili bolj široki (Mdm10 je sestavni del SAM kompleksa v OMM, ima še druge funkcije).
• Sevi z mutiranimi MDM34 in MLokaDM10 so izgubili ERMES stike, vsi fuzijski proteini pa so se lokalizirali na mitohondrij.
• Sevi z mutiranimi MDM1 so izgubili ERMES stike, vsi fuzijski proteini pa so se lokalizirali na endoplazemski retikulum.
• Sevi z mutiranim MDM12 so izgubili ERMES stike, v primeru mutacije/okvare gena MMM1, se MDM12-GFP lokalizira na mitohondrij, ob mutaciji/okvari MDM10 in MDM34 pa na ER.

V skladu s temi rezultati so postavili model kompleksa ERMES: Mdm34 in Mdm10 sta vezana v membrano mitohondrija, Mmm1 na membrano ER, protein MDm12 pa je vezan na Mdm12 in Mmm1 in ni lokaliziran v nobeni membrani <ref name="prvi"> </ref>.

Njihov model je torej predpostavljal, da je protein Mmm1 vstavljen v membrano ER, medtem ko so dosedaj menili, da je sestavni del mitohondrijske notranje ali zunanje membrane. Ker se to ne ujema, so se odločili natančneje preveriti tudi to.

1. test: Veliko integralnih ER proteinov je N-glikoziliranih na lumenski domeni in štiri potencialna mesta za glikozilacijo se nahajajo tudi na N-koncu pred transmembransko domeno. Da bi preverili, če so ta mest res glikozilirana, so gen za Mmm1 zamenjali z zapisom za fuzijski protein z HA (hemaglutinin). Nato so imeli tri vzorce – prvi je bil celični lizat tretiran z EndoHF (odstrani N-vezane glikane), drugi lizat ni bil tretiran z EndoHF, tretji pa je bil lizata seva z WT zapisom za Mmm1 (kontrola). Izvedli so NaSD-PAGE ter western prenos s protitelesi proti hemaglutininu. Lizat, tretiran z EndoHF je pripotoval dlje, kar pomeni da je protein res glikoziliran potemtakem integralni ER membranski protein <ref name="prvi"> </ref>.

2. test: v celico so vnesli konstrukt, ki izraža protein Mmm1, fuziran z HA in cepitvenim mestom za TEV proteazo. Prav tako so vnesli zapis, za TEV proteazo s signalnim petidom za ER (Kar2) ali pa mitohondrij (Su9). Celične lizate so nanesli na NaDS-PAGE, izvedli western prenos s anti-HA protitelesi, in dobili dve lisi v sistemu, ki je izražal Kar2-TEV proteazo. To pomeni, da se protein Mmm1 res nahaja na ER <ref name="prvi"> </ref>.

Vloge kompleksa ERMES v celici

Abc

Zaključek

Abc

<references/>