SONOBE - proteinski sistem za agregacijo mikroplastike

My Clothes Plastic<ref>My clothes plastic. iGEM 2019 team Kyoto. https://2019.igem.org/Team:Kyoto.</ref> je projekt študentske ekipe Kyoto iz Japonske, ki je bil nagrajen z zlato medaljo na tekmovanju iGEM 2019.

Avtorica povzetka: Vesna Podgrajšek

Mikroplastika

Človek v vsakdanjem življenju uporablja različne izdelke iz plastike. Težava, s katero se spopadamo je, da se plastika v naravnem okolju zelo počasi razgrajuje in se nenehno kopiči. Pri tem se zaradi abiotskih dejavnikov (UV-sevanje, temperatura) ustvarjajo delci plastike manjši od 5 mm, kar imenujemo mikroplastika<ref>A. K. Urbanek, W. Rymowicz, A. M. Mirończuk: Degradation of plastics and plastic-degrading bacteria in cold marine habitats. Appl. Microbiol Biotechnol. 2018, 102, 7669–7688.</ref>. Njena površina je zelo hidrofobna in gladka, zato se nevarne snovi, kot so težke kovine ter tudi mikroorganizmi zlahka pritrdijo nanjo. Ko mikroplastiko pojedo morski organizmi, jim škodi, hkrati pa ogroža celoten ekosistem. Prav tako je tudi človeško telo izpostavljeno mikroplastiki, zlasti z zaužitjem hrane in vdihavanjem mikroplastike iz zraka. Ocenjuje se, da človek letno zaužije od 39 000 do 52 000 delcev mikroplastike<ref>] J. C. Prata, J. P. da Costa, I. Lopes, A. C. Duarte, T. Rocha-Santos: Environmental exposure to microplastics: An overview on possible human health effects. Sci. Total Environ. 2020, 702, 1–31.</ref>. Mikroplastika ne nastane samo kot posledica razgradnje plastične embalaže in vrečk, ampak je tudi posledica pranja perila. V enem pranju perila nastane več kot 700 000 mikrovlaken in veliko tega ne zajamejo čistilne naprave, zato se sprostijo v okolje. Akumulacija mikroplastike je eden najresnejših okolijskih problemov. Ker še vedno ni učinkovitega načina za odstranjevanje mikroplastike iz okolja, so z uporabo sinteznobioloških orodij poizkusili odkriti način odstranjevanja mikrovlaken iz odpadne vode pranja in s tem preprečiti sproščanje v naravno okolje.

Projekt My clothes plastic

Ideja

Ideja ekipe Kyoto je bila razviti proteinski sistem SONOBE, ki bi spodbujal mikrovlakna, da se agregirajo in oborijo. V tem sistemu so proteini, ki vežejo plastiko (angl. plastic-binding protein, PBP), vezani na površino enkapsulinskega nanokompartmenta sestavljenega iz enkapsulinskih podenot. Vezava PBP je omogočena s sistemom SpyTag-SpyCatcher, ki spontano tvori močno izopeptidno vez, ki je ireverzibilna.

Proteinski sistem SONOBE se vnese v odpadno vodo s pomočjo naprave, ki so jo 3D natisnili in s katero opremimo pralni stroj. Naprava je zasnovana tako, da priskrbi proteinsko raztopino v odpadno vodo, samo ko pralni stroj spusti odpadno vodo. Mikrovlakna se na poti do čistilne naprave agregirajo in usedejo, nato pa jih še odstranijo in sežgejo.

Priprava konstruktov

Enkapsulin SpyTmEnc (BBa_K3185000) so konstruirali tako, da prikaže protein SpyTag na površini enkapsulinskega nanokompartmenta - organelu podobna struktura. 60 enkapsulinskih podenot spontano tvori polimer v obliki sferične kletke premera 20 nm<ref> Y. Bae, G. J. Kim, H. Kim, S. G. Park, H. S. Jung, S. Kang: Engineering tunable dual functional protein cage nanoparticles using bacterial superglue. Biomacromolecules. 2018, 19, 2896–2904. </ref>. Za izhodišče so vzeli enkapsulin iz bakterije Thermotoga maritima (TmEnc). Peptid SpyTag je vstavljen po 138. aminokislini v TmEnc in je izpostavljen zunaj proteinske kletke kot zanka. Konstruirali so še dva TmEnc; TmEnc (BBa_K3185001) in sfGFP/TmEnc (BBa_K3185002), kateri ima na N-konec dodano še zaporedje sfGFP (angl. superfolder green fluorescent protein). Vsi trije konstrukti vsebujejo C-končno heksahistidinsko oznako (6xHis-tag), pred to oznako je hemaglutininska oznaka (HA-tag) in med 43. in 44. aminokislino vstavljena še ena heksahistidinska oznaka (6xHis-tag).

Konstruirali so tudi sedem PBP, od katerih se vsak veže na različne tipe (polietilen tereftalat, PET; poliuretan, PU; polipropilen, PP) ter tudi oblike plastičnih materialov (mikrovlakna, folija, sintetična tkanina), kar omogoča fleksibilno uporabo sistema. Za izhodišče so vzeli PBP iz različnih organizmov (BaCBM2 iz bakterije Bacillus anthracis, CenA iz bakterije Cellulomonas fimi, izboljšana različica TA2 iz raka Tachypleus tridentatus, LCI KR-2 izboljšana različica LCI iz bakterije Bacillus subtilis, hidrofobin iz bakterije Bacillus subtilis, PETaza in izboljšana PETaza iz bakterije Ideonella sakaiensis). Vsak PBP je bil s fuzijo povezan s proteinom SpyCatcher (SpyC->BaCMB2: BBa_K3185004, SpyC->CenA: BBa_K3185005, SpyC->PETaza: BBa_K3185009, SpyC->ePETaza: BBa_K3185010). Dvema PBP (SpyC->sfGFP->LCI KR-2: BBa_K3185006, SpyC->sfGFP->TA2: BBa_K3185007) so na N-konec dodali še zaporedje sfGFP. Enemu PBP pa so dodali GST zaporedje (GST->SpyC->hidrofobin: BBa_K3185008). S tem pristopom lahko enkapsulinski nanokompartment veže do 60 s SpyCatcher povezanih PBP. Vsi proteini vsebujejo heksahistidinsko oznako (6xHis-tag) za čiščenje, oznako MYC (MYC-tag) za detekcijo s protitelesi ter prepoznavno mesto za proteazo TEV.

Eksperimentalni del in rezultati

Izražanja in čiščenje rekombinantnih proteinov

Najprej so klonirali deset genov oz. konstruktov za proteinski sistem SONOBE v plazmidih pET-11a. Konstrukte so vstavili med restrikcijski mesti za BamHI in NdeI. Ekspresijske plazmide so vnesli v celice BL21(DE3) in gene izrazili s T7 promotor/RNA polimeraznim sistemom. Vsak rekombinantni protein nosi polihistidinsko oznako (6xHis-Tag), zato so za čiščenje uporabili Ni-afinitetno kromatografijo. Čistost eluatov so potrdili z NaDS PAGE. Trije PBP (SpyC->PETaza, SpyC->ePETaza in SpyC->hidrofobin) od desetih se niso uspešno očistili.

Rekombinantni PBP se efektivno vežejo na površino plastike

S pomočjo treh testov, pri katerih so uporabili različne materiale iz PET, so poizkusili ugotoviti ali PBP le-to učinkovito vežejo in v kakšni meri.

Pri prvem testu so belo majico iz PET razrezali na kose in uporabili metodo točkovnega nanosa. Uporabili so PBP, ki so bili v fuziji s sfGFP (SpyC->sfGFP->LCI in SpyC->sfGFP->TA2). Različne redčitve PBP so nanesli na kos tkanine, inkubirali 20 min, sprali in detektirali fluorescenco. Tkanino so opazovali pred in po pranju. Intenzivnost vsake točke so količinsko določili z ImageJ. Po pranju so približno 65 % SpyC->sfGFP->LCI in 75 % SpyC->sfGFP->TA2 še vedno opazili na tkanini. S tem so dokazali, da se PBP res močno vežejo na tkanino iz PET.

Pri drugem testu so eksperiment izvedli s pomočjo bolj realistične tarče in sicer vlaken iz PET. Vlakna so namočili v vodi in raztopini PBP (SpyC->sfGFP->LCI in SpyC->sfGFP->TA2). Vlakna so sprali in opazovali rezultat s fluorescenčnim mikroskopom. Kontrolni eksperiment ni pokazal fluorescence, zato ta vlakna nimajo avtofluorescence. Sam sfGFP prav tako ni pokazal signalov, kar pomeni, da je vezava sfGFP na vlakna posredovana s PBP.

Z zadnjim eksperimentom v tem sklopu so želeli količinsko določiti PBP vezane na vlakna in jih primerjati. Enako količino vlaken so namočili v raztopino vseh štirih PBP, vlakna dobro sprali in PBP eluirali z vlaken. Eluate so nanesli na NaDS PAGE ter določili intenzivnost lis z ImageJ. Ugotovili so, da se SpyC->BaCBM2 in SpyC->CenA najboljše vežeta na vlakna. Po navedbah v literaturi sta BaCBM2 in CenA proteina, ki vežeta PET, LCI KR-2 je protein, ki veže PP in TA2 je protein, ki veže PU. Zato je rezultat skladen z literaturo. Zanimivo je, da sta SpyC->LCI KR-2 in SpyC->TA2 pokazala tudi zmerno vezavo na vlakna iz PET.

TmEnkapsulini pravilno naredijo sferičen polimer

Ekipo je zanimalo ali se rekombinantni proteini SpyTmEnc sestavijo v sferičen polimer oz. enkapsulinski nanokompartment. Zato so v ta namen ocenili velikost sferičnega polimera s centrifugiranjem v gostotnem gradientu saharoze, meritvijo absorbance pri 260 nm in NaDS PAGE. Kot kontrolo so uporabili bakterijske ribosome. Okoli 60. frakcije je bil jasno opazen vrh ter je sovpadal z vrhom ribosoma 70 S. Ker je velikost SpyTmEnc 20 nm in je bakterijski ribosom 70 S tudi 20 nm, je ta vrh ravno sferični polimer. Da bi potrdili, da je najvišji vrh 60. frakcije rezultat SpyTmEnc so frakcijo nanesli na NaDS PAGE in primerjali lise na gelu še z lizatom z izraženim SpyTmEnc in očiščenim SpyTmEnc. S tem so tudi potrdili svoj predhodnji rezultat, da je SpyTmEnc tvori sferičen polimer.

Konjugacija proteinov preko SpyCatcher/Spytag sistema

Enako količino raztopine PBP (SpyC->BaCMB2 in SpyC->LCI) in raztopine SpyTmEnc so zmešali in inkubirali pri sobni temperaturi. Vzorce so nanesli na NaDS PAGE. Rezultati so pokazali, da so in vitro uspešno konjugirali SpyC->PBS in SpyTmEnc preko SpyTag-SpyCatcher sistema.

Zanimalo jih je tudi časovni potek tvorbe vezi med SpyTag in SpyCatcher. Zato so enaki količini SpyC->PBS in SpyTmEnc zmešali in inkubirali pri sobni temperaturi 10 min, 30 min, 60 min, 180 min, 360 min ter 1200 min. Vzorce so nanesli na NaDS PAGE in merili intenzivnost lis s ImageJ. Lise, ki so rezultat konjugacije, postanejo postopoma vidne.

Mešanje proteinskega sistema SONOBE z mikrovlakni

Mikrovlakna velikosti okrog 1 mm so zmešali z vodo. Večina mikrovlaken je plavala na vodni gladini. Proteinski sistem SONOBE so pripravili z mešanjem SpyTmEnc in SpyC->sfGFP->LCI KR-2 ter ga dodali mikrovlaknom v vodi, katera so se oborila. Proteinski sistem SONOBE so dodali tudi v raztopino LCI KR-2. Vlakna so se oborila, zato so videli, da je obarjanje odvisno od LCI KR-2, kar bi lahko bil alternativni način za obarjanje mikrovlaken. Čeprav niso mogli jasno potrditi učinka enkapsulinskega nanokompartmenta, so nedvoumno pokazali, da lahko samo PBP prispevajo k obarjanju mikrovlaken.

Ker jih je zanimalo ali naprava dejansko agregira mikrovlakna so naredili še poskus merjenja velikosti delcev mikrovlaken z lasersko difrakcijo. Merili so tako premer delcev mikrovlaken kot tudi premer delcev mikrovlaken po dodatku proteinskega sistema SONOBE. Rezultate so predstavili z grafom odvisnosti porazdelitve premera delcev mikrovlaken od frekvence pojavljanja določenega premera. Premer mikrovlaken, ki so jih uporabili, je bil približno 15 μm. Rezultat kaže, da se nekaj delcev agregira v večje delce (snope) z dodajanjem proteinskega sistema, saj se je vrh med 10 μm in 20 μm zmanjšal. Pojavili so se delci večji od 20 μm.

Zaključek

Cilj projekta My clothes plastic je bil rešiti težavo sproščanja mikroplastike v odpadno vodo pri pranju perila in preprečiti sproščanje v naravno okolje. Ta sistem je enkapsulinski nanokompartment, na katerega se vežejo PBP preko sistema SpyTag-SpyCatcher. Proteinski sistem SONOBE se vnese v odpadno vodo in spodbuja mikrovlakna, da se agregirajo in oborijo. Poleg tega so izračunali optimalno količino proteinskega sistema, ki ga je potrebno dati v odpadno vodo za pranje perila, izdelali pa so tudi strojno opremo za uvedbo proteinskega sistema v odpadno vodo. Projekt so uspešno speljali do konca ter predstavili tudi možnosti za izboljšavo sistema.

Viri

<references/>