Priprava fotoinducibilne rekombinaze Dre kot orodje za prostorsko in časovno odvisno urejanje genoma v specifičnih mišjih celicah.

UVOD

Rekombinaza Dre izhaja iz bakteriofaga D6 in pripada družini tirozinskih rekombinaz. Deluje tako, da prepozna tarčna mesta rox, ki so sestavljena iz dveh 14 bp dolgih palindromskih ponovitev, med katerima se nahaja 4 bp dolg distančnik. Ob vezavi dveh rekombinaz na tarčni mesti, se le ti stakneta, pri čemer Dre cepi zaporedje znotraj distančnika, kar privede do izmenjave verig in s tem do rekombinacije [1,2].

Fotoinducibilno rekombinazo so pripravili na osnovi fuzije s cepljenimi proteini; rekombinazo Dre so cepili na dva nefunkcionalna fragmenta, ki se ne moreta več združiti skupaj, ter ju fuzirali s proteini iz fotodimerizacijskih sistemov. Ob prisotnosti svetlobe določene valovne dolžine fuzijska partnerja dimerizirata, pri čemer se fragmenta Dre združita v aktivno celoto [1, 3].

POTEK EKSPERIMENTA

Ker kristalna struktura Dre še ni bila rešena, so raziskovalci potencialna mesta cepitve določili s pripravo modela kristalne strukture Dre na osnovi homologije z rekombinazo Cre. Pare fragmentov iz pridobljenih mest cepitev so dali čez dva presejalna testa. V prvem so kot fuzijska partnerja uporabili dimerizacijski Coh2 Docs, v drugem pa fotodimerizacijska sistema CRY2-CIB1 ter Magnets (nMag-pMag). Konstrukte s fuziranimi fragmenti so skupaj z reporterjem rox-stop-rox-Rluc preko transfekcije vnesli v celice HEK293T ter merili aktivnost luciferaze [1].

Sledila je optimizacija fotoinducibilne Dre (PA-Dre), pri čemer so uporabili najboljši par fragmentov iz presejalnih testov ter sistem Magnets. Tekom optimizacije so primerjali:

• različne kombinacije položajev fuzijskih partnerjev
• različne distančnike (L)
• vpliv jedrskega lokalizacijskega signala (NLS)

Delovanje PA-Dre so nato preverili v in vitro ter in vivo pogojih. Pri poskusih in vitro so v transficiranih celicah primerjali izražanje reporterskih proteinov v odvisnosti od časa izpostavljenosti ter intenzitete modre svetlobe. Dodatno so preverjali še prostorsko odvisnost delovanja PA-Dre z uporabo maske, ki je prepuščala svetlobo le na določenih delih. V sklopu in vivo eksperimentov so mišim v repno veno injicirali plazmida s PA-Dre in reporterskim proteinom, jih obsevali 8 h ter izmerili signal. Rezultate so primerjali z mišmi, katerim so injicirali PA-Cre [1].

Za konec so zasnovali sistem CALID (Cre-activated light-inducible Dre), ki je sestavljen iz:

• rekombinaze Cre (na svojem vektorju ali že prisotna kot transgen v organizmu)
• vektor z inverzno orientiranim zapisom za PA-Dre, ki je obdan z mesti lox v inverzni orientaciji
• tarčni gen, ki je obdan z mesti rox

Sistem so testirali tako, da so inverzno orientiran zapis za PA-Dre preko virusnega vektorja AAV9 vnesli v možgane rekombinantnih miši, ki so izražale rekombinazo Cre samo v celicah internevronov, ki proizvajajo parvalbumin (PV), poleg tega pa so vsebovale transgen z reporterskim proteinom, pred katerim je bil z mesti rox obdan stop kodon. Mišje možgane so en teden po injekciji obsevali z modro svetlobo preko optičnih vlaken in spremljali signal. Negativno kontrolo so predstavljale miši, ki so bile ves čas v temi [1].

REZULTATI

Pri presejalnih testih so najmočnejše signale in najboljše razmerje signal/šum dobili s parom fragmentov DreN₂₄₆/DreC₂₄₇, fuzirana s proteini iz sistema Magnets [1].

Tekom optimizacije so ugotovili, da najboljše rezultate izkazujeta konstrukta: DreN₂₄₆-L4-nMag in pMag-L4-DreN₂₄₇-NLS^NLP [1].

In vitro eksperimenti so pokazali, da intenziteta signala reporterskega proteina narašča s časom obsevanja in se nasiči pri 32 urah. Poleg tega tudi narašča z intenziteto svetlobe; nasiči se pri intenziteti 1 mW/cm². Pri eksperimentu z masko je prišlo do signala samo na mestih, kjer je svetloba lahko prehajala čez masko. In vivo eksperimenti so pokazali, da PA Dre deluje tudi v živih organizmih, poleg tega pa je bilo prisotnega manj šuma kot pri PA Cre [1].

Za konec so ugotovili, da je sistem CALID učinkovit za urejanje genoma v specifičnih mišjih celicah; signal reporterskega proteina so namreč zaznali samo v celicah internevronov PV, poleg tega pa signal ni bilo prisoten pri negativnih kontrolah. Ugotovili so tudi, da intenziteta in čas obsevanja tudi v tem primeru vplivata na količino celic, ki izražajo reporterski protein [1].

ZAKLJUČEK

Raziskovalna skupina je razvila rekombinazo Dre, ki se preko sistema Magnets aktivira v prisotnosti modre svetlobe. S presejalnimi testi in optimizacijo so dobili sistem, ki izkazuje visoko učinkovitost in odlično razmerje signal/šum. Z in vitro in in vivo poskusi so dokazali, da je PA-Dre učinkovita tudi v živih organizmih in je prostorsko ter časovno odvisna, s poskusi na sistemu CALID pa so dokazali, da le ta predstavlja uporabno orodje za urejanje genoma v specifičnih vrstah celic [1].

VIRI

1. H. Li, Q. Zhang, Y. Gu, Y. Wu, Y. Wang, L. Wang, S. Feng, Y. Hu, Y. Zheng, … D. Li: Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2021, 117(52), str. 33426–33435.
2. K. Anastassiadis, J. Fu, C. Patsch, S. Hu, S. Weidlich, K. Duerschke, F. Buchholz, F. Edenhofer, A. F. Stewart: Dre recombinase, like Cre, is a highly efficient site-specific recombinase in E. coli, mammalian cells and mice. DMM Dis. Model. Mech. 2009, 2(9–10), str. 508–515.
3. L. Benedetti, J. S. Marvin, H. Falahati, A. Guillén-Samander, L. L. Looger, P. De Camilli: Optimized vivid-derived magnets photodimerizers for subcellular optogenetics in mammalian cells. Elife 2020, 9, str. 1–49.