Avtomatizirano oblikovanje sintezne mikrobne združbe

Povzeto po članku: B. D. Karkaria, A. J. H. Fedorec, and C. P. Barnes, “Automated design of synthetic microbial communities,” Nat. Commun., vol. 12, no. 1, pp. 1–12, 2021. doi: 10.1038/s41467-020-20756-2

Uvod

Mikrobno združbo predstavljajo različne populacije mikroorganizmov, ki med seboj interagirajo preko izmenjevanja različnih signalnih molekul. To predstavlja prednost pred posameznimi monokulturami, saj so posamezne populacije znotraj združbe bolj odporne na okoljske spremembe, kot sta na primer invazija neželenih vrst in pomanjkanje hranil. [1]

Posamezne populacije mikroorganizmov v določeni združbi med seboj komunicirajo preko izmenjave metabolitov ali molekularnih signalov, s tem pa lahko vsaka populacija v združbi zaznava in se odziva na prisotnost drugih populacij. Pri bakterijah predstavljajo mikrobno združbo biofilmi, komunikacija pa poteka preko signalnih molekul, virulentnih dejavnikov ali majhnih peptidov (npr. bakteriocini). Preko intermediatov, ki nastajajo, lahko tako posamezne populacije v združbi pozitivno ali negativno regulirajo aktivnost drugih. Poleg komunikacije poteka v združbah tudi delitev dela med posameznimi populacijami, kar omogoči tvorbo kompleksnih produktov ali razgradnjo kompleksnih substratov. Z delitvijo dela se zmanjša metabolno breme posamezne populacije, kar pozitivno vpliva na mikrobno rast. [1, 2]

V sintezni biologiji se je sistem sintezne mikrobne združbe razvil z namenom spodbujanja rasti določenih vrst bakterij in sinteze kompleksnejših spojin, ki jih posamezen sev v monokulturi ni sposoben proizvesti sam. Zaradi povečane sposobnosti preživetja in rasti mikrobne združbe v primerjavi z monokulturami, je ta bolj primerna za biotehnološke aplikacije, poleg tega pa predstavlja obetavno orodje za upravljanje človeškega in okoljskega mikrobioma za namene zdravljenja oziroma uporabe v kmetijstvu. [3]

Postopek sinteze mikrobne združbe

Prvi korak pri ustvarjanju sintezne mikrobne združbe je ustvarjanje ustrezne komunikacije med celicami. Pri tem se pri bakterijah izkoriščajo komponente, ki sodelujejo pri sistemu quorum-sensing (QS). Izkoriščanje sistema QS omogoča, da je obnašanje celotne združbe regulirano z izmenjavo majhnih signalnih molekul, kot je acil-homoserin lakton, ki je tudi najpogosteje uporabljen sistem v sintezni biologiji. [1] Poleg tega sistema lahko komunikacija poteka tudi preko proteinov, ki sodelujejo pri lizi celice, encimi, ki sodelujejo pri metabolizmu določenih spojin, toksinov in pa protimikrobnih peptidov. V opisanem članku so se odločili za zadnje, in sicer za uporabo bakteriocinov, ki vplivajo na hitrost rasti določenih populacij, ki so občutljive na bakteriocin. [4]

Pri načrtovanju mikrobne združbe v primeru izkoriščanja sistema z bakteriocini se lahko izkorišča šest različnih načinov medsebojne interakcije, med katerimi so komenzalizem, amenzalizem, nevtralizem, kooperacija, kompeticija in predatorstvo. [3]

V sintezni biologiji je uporaba napovednih modelov nujna, saj je v sistemu veliko različnih parametrov, ki vplivajo na uspešnost sinteze stabilne združbe. V opisanem članku so najprej z uporabo programa AutoCD (Automated synthetic microbial Community designer) avtomatizirano generirali vse kandidatne sisteme, ki lahko tvorijo mikrobno združbo iz seta bioloških delov in danih parametrov. [4]

Model pri tem predstavlja skupek večih parametrov, ki upoštevajo število sevov, sistemov QS in bakteriocinov v določenem sistemu. Kot primer združbe dveh vrst predstavlja en takšen model dva seva (npr. sev N1 in N2), dva bakteriocina (B1, B2) in dva sistema QS (A1, A2). Pri modelu je potrebno definirati še dodatne omejitve, kot so naprimer izražanje števila različnih sistemov QS in število izraženi bakteriocinov pri posameznem sevu, ter občutljivost posameznega seva na različne bakteriocine.

Na podlagi kandidatnih sistemov so nato z uporabo orodja ABC SMC (Approximate Bayesian computation with sequential Monte Carlo sampling) simulirali in izbrali le tiste modele, ki so najbolj verjetni za tvorbo stabilne dvo- in tro-vrstne mikrobne združbe ob vzpostavitvi dinamičnega ravnotežja. To so izbirali na podlagi treh parametrov v dinamičnem ravnotežju, in sicer na podlagi gradienta populacij, standardne deviacije med posameznimi simulacijami in koncentracijo bakterij posameznega seva. Dodatni parameter, ki so ga pri tem upoštevali je še dopuščena stopnja odstopanja med želenim in simuliranim obnašanjem.

Orodje ABC (Approximate Bayesian computation) je osnovano na Bayesovem teoremu, ki lahko glede na podatke napove statistično najbolj ustrezno razporeditev sistema. ABC se pogosto uporablja za napovedne modele v primeru reševanja kompleksnih problemov pri bioloških vedah, kot je v konkretnem primeru napoved modela za dosego najbolj stabilne mikrobne združbe. V grobem to orodje napove, kateri model bo najbolje opisal realno stanje sistema glede na parametre, dobljene pri simulacijah. Orodje ABC SMC pomaga identificirati tudi ključne parametre, ki omogočajo tvorbo ustrezne gostote populacije posameznih sevov, ki je potrebna za dosego dinamičnega ravnotežja pri določeni združbi. Parametre, ki se pri tem upoštevajo, je možno regulirati direktno z nastavitvijo stopnje redčitve posameznih populacij sevov, z izbiro ustreznih promotorjev ali RBS (hitrost izražanja bakteriocinov) in pa z izbiro seva ali vrste bakterije (hitrost rasti posameznega seva).

Potek dela in rezultati

Dela so se lotili tako, da so najprej v program Auto CD vnesli vse serije vhodnih podatkov, ki so potrebni za sintezo sistema biološke združbe v bioreaktorju. Pri tem so poleg preostalih parametrov upoštevali, da so vsi mikrobni sevi odvisni od enega vira hranil, ki se ga lahko regulira preko vnosa medija v bioreaktor. Serije vhodnih podatkov so vstavili v naključni generator parametrov modela iz obstoječega prostora možnih parametrov, s katerim so preko diferencialnih enačb z upoštevanjem pogojev bioreaktorja pridobili vse možne kombinacije kandidatnih modelov, ki upoštevajo dane omejitve. Pri tem so uporabili različne funkcije, ki opisujejo oddaljenost posamezne simulacije od dejanskega stanja dinamičnega ravnotežja. Preko teh funkcij nova enačba definira pogoje, pri katerih se bo določena simulacija najbolje približala želenemu dinamičnemu ravnotežju.

Temu je sledilo filtriranje podatkov z uporabo orodja ABC SMC, s čimer so naredili selekcijo le najbolj verjetnih modelov. Izhodni podatki, ki so jih dobili s pomočjo programskih orodij, predstavljajo tiste modele, ki napovedujejo največjo verjetnost za tvorbo stabilne mikrobne združbe v dinamičnem ravnotežju pri določenih pogojih bioreaktorja.

Načrtovanje združbe dveh vrst

Pri načrtovanju združbe dveh vrst so definirali pogoje, ki upoštevajo prisotnost ali odsotnost izražanja sistema QS, prisotnost odsotnost izražanja bakteriocina ter način regulacije. Poleg tega so upoštevali še občutljivost posamezne vrste na bakteriocine. Iz nabora možnih kandidatnih modelov so z uporabo dodatnih pogojev odstranili še neustrezne seve.

Pri pogojih so upoštevali, da lahko vsaka vrsta izraža največ en sistem QS, največ en bacteriocin ter da je vsaka vrsta lahko občutljiva na največ en bacteriocin. Z vnosom vseh pogojev je generator generiral 69 kandidatnih modelov, z uporabo ABC SMC sistema pa so nato izbrali najbolj verjetne kombinacije, izmed katerih je bil najbolj obetaven model m62, kjer sta si mikrobna seva medsebojno v zaščitniškem mutualizmu. Pri tem modelu posamezna seva izražata samo-omejujoča bakteriocina, ki delujeta na tisti sev, ki ta bacteriocin izraža, pri tem pa sistem QS enega seva zavira nastanek bakteriocina drugega seva, in s tem omogoči njegovo preživetje.

Nato so z uporabo strojnega učenja preko metode nenegativne matrične faktorizacije (ang. NMF) preučili, kateri motivi in kako vplivajo na stabilnost združbe. S tem so sestavili model, ki upošteva, katere interakcije dajejo večjo težo na stabilnost določene združbe, kar omogoči vpogled v spremembo verjetnosti uspešnosti modela s spreminjanjem posameznih motivov. V primeru načrtovanja združbe dveh vrst je model pokazal, da samo-omejujoči motivi bolj verjetno omogočijo nastanek stabilne združbe.

Načrtovanje združbe treh vrst

Dodaten mikrobni sev v združbi je bistveno povečal razsežnost parametrov, možnosti izvedbe in možnosti interakcij med vrstami. Pri načrtovanju mikrobne združbe treh vrst so upoštevali enake omejitve kot v primeru mikrobne združbe dveh vrst.

Pri tem so najprej dobili 4182 možnih kombinacij, ki so jih razvrstili v skupine. Z uporabo orodja ABC SMC se je za najbolj verjetni model, ki bi tvoril stabilno združbo, izkazal model m4119, pri katerem je prisoten sistem dveh QS molekul in treh vrst bakteriocinov. Pri tem, enako kot v primeru združbe dveh vrst, QS molekule zavirajo izražanje samo-omejujočih bakteriocinov, ki jih izloča posamezen sev.

Zaključek

Pri načrtovanju sinteznih mikrobnih združb so pomembne medcelične interakcije, ki posnemajo ekološke interakcije, ki jih najdemo v naravi. V opisanem članku so s pomočjo sistema ABC SMC identificirali optimalni model, ki je sposoben tvoriti stabilno mikrobno združbo, sestavljeno iz dveh oziroma treh različnih sevov, in sicer z uporabo bakteriocinov in sistema zaznavanja kvoruma (QS). V obeh primerih načrtovanja mikrobne združbe se je izkazalo, da je za dosego stabilne združbe najbolj primeren način interakcije mutualizem oziroma kooperativnost. Pri tem so se za dosego dinamičnega ravnotežja najbolje obnesli modeli, kjer so prisotni samo-omejujoči bakteriocini. Količina izločenih bakteriocinov, ki vplivajo na stabilnost posameznega seva, je močno odvisna od gostote seva, povečevanje števila različnih vrst bakteriocinov pa vpliva na povečano stabilnost mikrobne združbe. [4]

Pri tem orodje ABC SMC dobro napove, katere pogoje je potrebno upoštevati pri eksperimentalnem načrtovanju sinteze mikrobne združbe za dosego uspešne vzpostavitve dinamičnega ravnotežja med sevi v določenem sistemu. Razvoj sistema za avtomatizirano oblikovanje mikrobne združbe omogoča dober vpogled v parametre in pogoje, s katerimi je mogoče razviti stabilno sintezno mikrobno združbo tudi v praksi. [4]

Literatura

[1] K. Brenner, L. You, and F. H. Arnold, “Engineering microbial consortia: a new frontier in synthetic biology,” Trends Biotechnol., vol. 26, no. 9, pp. 483–489, 2008.

[2] C. V. Dinh, X. Chen, and K. L. J. Prather, “Development of a Quorum-Sensing Based Circuit for Control of Coculture Population Composition in a Naringenin Production System,” ACS Synth. Biol., vol. 9, no. 3, pp. 590–597, 2020.

[3] W. Kong, D. R. Meldgin, J. J. Collins, and T. Lu, “Designing microbial consortia with defined social interactions,” Nat. Chem. Biol., vol. 14, no. 8, pp. 821–829, 2018.

[4] B. D. Karkaria, A. J. H. Fedorec, and C. P. Barnes, “Automated design of synthetic microbial communities,” Nat. Commun., vol. 12, no. 1, pp. 1–12, 2021.

[5] Approximate Bayesian computation - Wikipedia https://en.wikipedia.org/wiki/Approximate_Bayesian_computation (pridobljeno 10. 5. 2021)