Samoreplicirajoč COVID-19 test

SEED-samoreplicirajoč COVID-19-test je iGEM-projekt iz leta 2020. Avtorji projekta so podiplomski študenti Univerze v Stanfordu v Kaliforniji.

Spletna stran projekta: [1]

Avtorica povzetka: Irma Zeljković

Uvod

Skupina je začela razmišljati o projektu sredi pandemije COVID-19. Ena od glavnih težav je bila takrat pomanjkanje možnosti testiranja, s katero bi lahko lažje spremljali in izolirali primere. Dve glavni pomanjkljivosti takratnih testov, sta bili potreba po izobraženem kadru in dragi reagenti. Skupina je imela idejo, da bi ustvarili test, ki bi lahko repliciral sam in ne bi potreboval usposobljenega kadra in laboratorijske opreme. [1]

Opis projekta

Sistem, ki so si ga zamislili sestoji iz treh korakov:

• Vnos nukleinske kisline v bakterijsko celico
• Intracelularna detekcija (RNA toehold ali homologna rekombinacija)
• Intracelularno signaliziranje (prek quorum sensing poti)

Rezultati so hitri in kolorimetrični. [1]

Vnos nukleinske kisline iz okolja

Odločili so se za delo z bakterijo Bacillus Subtilis, saj gre za naravno kompetentno bakterijo, ki je prepoznana kot GRAS. Kompetentna B. subtilis izraža specializirane proteine, ki so vstavljeni v kompleks za transport DNA prek membrane. ComEA veže nase DNA. Nato na DNA deluje protein ComG, ki pomaga pri prenosu skozi bakterijsko steno. Ob prehodu nanjo delujejo endonukleaze in DNA se cepi na fragmente. Prehod skozi citoplazemsko membrano pa omogoča protein ComEC, ki pa znotraj membrane tvori proteinsko poro in omogoča prehod le enoverižni DNA. Ko je DNA transportirana v celico jo B. subtilis integrira v kromosom. [2] Naravna kompetenca B. subtilis je posledica pomanjkanja hranil v okolju. Regulacija kompetence je zelo zapletena, ključna proteina sta ComK in ComX. ComK je transkripcijski faktor, ki se izrazi po končani eksponentni fazi rasti. Njegova ekspresija je stimulirana s feromonom ComX, ki ga izločajo druge celice s pomočjo poti quorum-sensinga zaradi povečane gostote celic. Skupina se je odločila za uporabo sevov, ki imajo možnost inducibilne superkompetentnosti. [3]

Za detekciji s t.i. RNA-toehold stikali so uporabili sev SCK6. V tem sevu je gen ComK pod kontrolo ksiloznega inducibilnega promotorja PxylA. Dodatek ksiloze v kulturo B. subtilisa povzroči ekspresijo DNA transportnih proteinov in začne kompetentnost. Za sistem, ki je temeljil na rekombinaciji so uporabili sev REG19. Pri tem sevu je ComK pod kontrolo manitolnega inducibilnega promotorja PmtIA, skupaj z genom za kompetenco ComS. Dodatek manitola v gojišče začne kompetentnost bakterij. [1]

Detekcija tarčne sekvence v celici

Ko je DNA v celici, je naslednji korak intracelularna detekcija. Skupina je poskusila 2 možna pristopa in sicer RNA-toehold stikala in z integracijo okoljske DNA v genom B.subtilis s homologno rekombinacijo. [1]

Detekcijska metoda 1: RNA toehold stikala

RNA-toehold stikala so preprosti detektorji, ki jih proizvaja celica in jih lahko uporabljamo in vivo in in vitro. Gre za enoverižno RNA, katere struktura se tako zvije, da tvori zanko. Takšna RNA je sestavljena iz 5 delov: sprožilca, RBS, začetnega kodona, linkerja in reporterja. V normalnih razmerah, ko RNA veriga tvori zanko, sta RBS in začetni kodon blokirana in ne more priti do translacije RNA. Ko pa tarčna sekvenca pride v bližino verige RNA, se komplementarno veže na sprožilec in povzroči, da se zanka razvije. Zaradi tega pride do izpostavitve RBS-mesta in ribosomi se lahko vežejo na RNA. Prednosti tega sistema so, da z lahkoto lahko zamenjamo različne sekvence, da je visoko specifičen, lahko zazna več tarč v eni celici ter da ga lahko proizvajamo in vivo. Skupina je naredila toehold RNA, ki se integrirajo na plazmid pVeg YFP. Sprožilec je komplementaren genu KanR, ki ga je skupina izbrala kot tarčno sekvenco. Za RBS so uporabili sekvenco, ki je v B. subtilis specifična za vezanje ribosomov. Kot reporter pa so uporabili YFP, saj hitro difuzira in je rumene barve. [4]

Detekcijska metoda 2: Homologna rekombinacija

Drug način detekcije RNA je rekombinacijski sistem B. subtilis, kjer poteče integracija DNA v kromosom s homologno rekombinacijo. Najprej so transformirali plazmid z negativnim selekcijskim markerjem, ki ga obkrožajo homologne regije tarčne sekvence. Ko celica prevzame sekvenco, se začne proces rekombinacije, ki povzroči, da se gen za negativno selekcijo izreže in ga nadomesti tarčna sekvenca. Če ne pride do prevzema DNA, tudi do rekombinacije ne pride in negativen selekcijski marker ostane v celici. Ta pa vodi v smrt celice ob prisotnosti manoze. [1]

Skupina je izbrala ManP za negativni selekcijski marker. ManP deluje, tako da fosforilira manozo, ko vstopa v celico in tako onemogoča njen izstop iz celice. Sev REG19 ima izbit gen ManA, ki bi manozo spremenila v fruktozo, zato se fosforilirana manoza nabira v celici.

Prisotnost tarče sekvence povzroči homologno rekombinacijo, saj je skupina svoj sev B. subtilis načrtovala z dvema regijama homologije tarčnih sekvenc, ki so vključene v genom na obeh straneh kasete ManP. Prednosti rekombinantnega sistema so, da se ta proces že naravno odvija v B. subtilis. Slabosti pa so specifičnost (lahko pride do več lažno pozitivnih testov), občutljivost (sistem ne zazna tarčnih sekvenc, če jih je premalo) in ima omejeno hitrost. [1]

Ojačevanje signala za hitreje branje

Naslednja faza je ojačevanjevidnega signala, ki so ga dobili z enim izmed sistemov. To fazo so le opisali, niso pa je preizkusili v laboratoriju zaradi težav s časom. Ojačevanje signala je pomembna, saj omogoča merljive rezultate v celi bakterijski koloniji tudi ob prisotnosti zelo malo nukleinske kisline. V ta namen so se odločili, da bojo uporabili quorum sensing. Ko kultura B. subtilisa doseže kritično gostoto, se aktivirajo quorum sensing molekule. Takšna molekula je na primer ComX, ki aktivira pot za aktivacijo promotorja PsrfA. Posledica tega je, da nastane bakterijski biofilm. Nova pot, ki jo je skupina naredila, vključuje pozitivno povratno zanko ComX in povzroči, da celice tvorijo fluorescentne proteine (namesto biofilma). To so storili, tako da so prvo izbili endogen ComX, in ga nadomestili s ComX, ki je bil pod kontrolo promotorja srf-A, PsrfA. Pod tem promotorjem bi bili tudi luxABCDE, ki so bioluminiscentni reporterji, ki si jih je skupina izbrala. Želeli so torej doseči, da bi izražanje Comx molekul aktiviralo PsrfA gene, ki bi proizvedli še več ComX in luxABCDE. Ojačevanje signala so morali združiti z mehanizmoma za zaznavanje DNA. Pri toehold stikalu bi razvitje zanke povzročilo translacijo ComX. Pri homologni rekombinaciji pa bi le-ta omogočila transkripcijo ComX.[1]

Uporabljeni biološki deli

Skupina je poskusila razviti 8 bioloških delov, ki jih lahko razdelimo v tri skupine: reporterji, detektorji, ki temeljijo na rekombinaciji in toehold. Nato pa so konstruirali še napravo za ojačitev signala, ki je niso mogli preizkusiti v laboratoriju. Prispevek skupine je bil torej devet biokock, saj so mnoge biokocke v registru kompatibilne, vendar ne optimizirane za delo z bakterijo B. subtilis.

V tabeli 1 so prikazani vsi biološki deli, ki so jih pripravili med projektom.

Tabela 1: Biološki deli, ki jih je skupina pripravila med projektom.

KODA	IME S BIOLOŠKEGA DELA
BBa_K3697000	mCherry BSU
BBa_K3697008	YFP CDS
BBa_K3697010	mCherry_BSU Plasmid
BBa_K3697009	pVEG YFP Plasmid for B. subtilis
BBa_K3697002	ManP Expression Casette
BBa_K3697003	Homology Arms for KanR Integration In B. subtilis
BBa_K3697004	Recombination-Based Detection System for B. subtilis (ManP)
BBa_K3697011	Toehold for Detection of KanR in B. subtilis
BBa_K3697012	Signal Amplifier Using B. subtilis Quorum Sensing Molecule comX

Zaključek

Ideja projekta SEED se lahko uporabi za različne aplikacije, vendar pa se je skupina osredotočila na virusno diagnostiko. Gre za ne invaziven test, kjer lahko dobimo rezultate iz sline. Skupina je pokazala predvsem proof of concept, vendar pa bi se pred uporabo takega testa v komercialne namene moralo narediti še klinična testiranja. Seed pa bi bilo možno uporabljati tudi za druge namene. V zdravstvu bi ga lahko uporabljali tudi za testiranje drugih virusov (predvsem DNA). Možna pa je tudi uporaba v agronomiji in pri testiranju vode in hrane.

Viri

• [1] Team: “Stanfors - 2020.igem.org.” https://2020.igem.org/Team:Stanford (accessed May 09, 2021)
• [2] Maier, B., Chen, I., Dubnau, D., & Sheetz, M. P. (2004). DNA transport into Bacillus subtilis requires proton motive force to generate large molecular forces. Nature structural & molecular biology, 11(7), 643–649. https://doi.org/10.1038/nsmb783
• [3] Hamoen, L., Venema, G., & Kuipers, O. (2003). Controlling competence in Bacillus subtilis: Shared use of regulators. Microbiology. 149:9-17. Retrieved May 15, 2014, from http://gbb.eldoc.ub.rug.nl/FILES/root/2003/MicrobiolHamoen/2003MicrobiolHamoen.pdf
• [4] Hong, F., Ma, D., Wu, K., Mina, L.A., Luiten, R.C., Liu, Y., Yan, H., Green, A.A. 57214766484;57189763666;57215219536;14037633900;57206179773;57216667908;7403395897;55328809600; Precise and Programmable Detection of Mutations Using Ultraspecific Riboregulators (2020) Cell, 180 (5), pp. 1018-1032.e16.