Odkritje transpozicijskih elementov pri bakterijah

Kaj je nakazovalo na obstoj transpozicijskih elementov pri bakterijah?

Pri odkritju transpozicijskih elementov je zanimivo to, da jih ni nihče iskal, temveč so spoznanja znanstvenikov, ki so preučevali druga področja (kromosomsko nestabilnost, odpornost na antibiotike itd.) počasi tlakovala pot njihovemu odkritju. Ta pot pa ni bila enostavna, saj je bilo prepričanje, da je genom nepremičen, močno vsidrano v miselnost tedanjega časa.

Izsledki raziskav Barbare McClintock iz poznih 40. let 19. stoletja, ki so nakazovali obstoj transpozicijskih elementov pri koruzi, so bili sprejeti kot odstopanje od normalnega in ne kot univerzalna lastnost genoma. Odkritje plazmidov in bakteriofagov je nekoliko normaliziralo koncept premičnih genetskih elementov, splošno sprejetje pa so transpozoni dočakali šele nekaj desetletij kasneje, ko jih je ekipa James. A. Shapira odkrila pri bakterijah.

Do tega trenutka sta bila edina poznana načina povečevanja biotske raznovrstnosti mutacije in homologna rekombinacija. Mutacije, naključne spremembe nukleotidnega zaporedja, so redke in brez učinkovitega načina prenašanja med organizmi ne morejo predstavljati gonilne sile evolucije. Do homologne rekombinacije pride pri nastanku spolnih celic, ko se homologna alela na paru kromosomov zamenjata. To je možno le, če sta si zaporedji med seboj zelo podobni. Pri nižjih organizmih, kot so bakterije, kjer spolno razmnoževanje ne poteka, do homologne rekombinacije lahko pride, ko v celico vstopi tuja DNA. Tja jo lahko prinese bakterijski virus – bakteriofag, v tem primeru govorimo o transdukciji, plazmid, ki se pri procesu konjugacije prenese iz ene bakterije v drugo, ali pa prosta DNA s transformacijo vstopi v bakterijsko celico. Da se del nove DNA lahko zamenja z delom genoma po principu homologne rekombinacije, mora biti sorodne strukture in izvora.

V drugi polovici 19. stoletja pa so se začeli vrstiti dokazi o poteku »nedovoljenih« rekombinacijskih procesov, ki jih ni bilo moč pojasniti z že odkritimi procesi.  Eden izmed njih je bilo odkritje celotnega razreda mutacij pri E. coli, za katerega je bil značilen vpliv na oddaljene gene, kjer mutacije sploh ni bilo. Danes vemo, da je prišlo do spremembe na regulatornem delu zaporedja, le nekaj let po odkritju dvojno vijačne strukture DNA pa to ni bilo tako očitno. Ko so mutirane gene vstavili v bakteriofage in jih centrifugirali v gradientu cezijevega klorida, so ugotovili, da so gostejši in torej daljši od naravnih različic. Sklepali so, da je do mutacije prišlo zaradi vstavitve do 2000 nt dolgega zaporedja in ne zaradi zamenjave. Tega in še nekaj drugih zaporedji, ki so jih poimenovali IS (insercijska zaporedja) so kasneje odkrili še v drugih genih in zaključili, da bi bilo precej neverjetno, da bi bilo teh nekaj zaporedij visoko homolognih vsem tem insercijskim mestom.

Približno ob enakem času - 1960 je več raziskovalnih skupin po svetu preučevalo prenos zapisa za odpornost proti antibiotikom iz plazmida na bakterijski kromosom. Za homologno rekombinacijo bi lahko šlo, če bi bil na kromosomu že prej prisoten zelo podoben gen za rezistenco, vendar ni bil, saj bakterije niso kazale znakov odpornosti. Kasneje so dokazali, da je proces soroden inserciji IS, saj se je povečala tudi dolžina akceptorskega zaporedja.

Odkritje transpozicije zapisa za rezistenco je bilo ključno za nadaljnje raziskovanje transpozicijskih elementov tudi zato, ker je omogočilo enostavno sledenje premikom insercijskih zaporedij. V obdobju pred sekvenciranjem je bilo le to možno le z opazovanjem posledic vstavitve IS na različna mesta na genomu in preizkus odpornosti na antibiotik je precej lažje ovrednotiti kot transpozicijo kakšne druge lastnosti. Kasneje so za ta namen začeli preučevati transpozicijo na laktozni operon. Če je bil gen aktiven, je nastala betagalaktozidaza, ki je X-gal v gojišču razgradila do modrega produkta.

Lastnosti insercijskih zaporedij in transpozonov

V bakterijah obstajata dva osnovna tipa transpozicijskih elementov, že zgoraj omenjena insercijska zaporedja (IS) in prokariontski transpozoni.

Insercijska zaporedja so najenostavnejši tip transpozicijskih elementov. Po navadi so to kratka zaporedja, ki vsebujejo le gen za encim, ki katalizira proces transpozicije – transpozazo. Pri vseh tipih IS se ta gen nahaja med koncema, ki predstavljata inverzne ponovitve komplementarnih zaporedij.

Prokariontski transpozoni so podobni insercijskim zaporedjem, le da so daljši in lahko poleg gena za transpozazo vsebujejo tudi druge gene. Poznamo dva tipa – sestavljene in nesestavljene.

Sestavljen transpozon vsebuje dve insercijski zaporedji, med katerima je lahko več genov. Zapisujejo lahko karkoli, vendar so najpogosteje to geni za odpornost na antibiotike.

Tudi nesestavljeni transpozoni lahko vsebujejo druge gene, od sestavljenih se razlikujejo le po tem, da ne vsebujejo končnih insercijskih zaporedij. Zapisi za te gene se nahajajo le med dvema inverznima ponovitvama. Primer takega transpozona je Tn3.

Pri preučevanju gena za odpornost na ampicilin so z elektronskim mikroskopom opazili, da se pri prenosu odpornosti med plazmidi prenese del zaporedja, dolg 4800 nukleotidov in, da se ta del lahko vstavi na več različnih mest na »gostiteljski« DNA. Na koncih tega zaporedja pa so opazili tudi nukleotidni zaporedji, ki sta med seboj obratno komplementarni – inverzni ponovitvi. Dolgi sta od nekaj do tudi 1400 nukleotidov. Njihov obstoj so dokazali z eksperimentom, pri katerem so ločili verigi dvoverižnega plazmida, ki je vseboval transpozon in ju pustili, da sta se zopet povezali, vendar vsaka sama s sabo. Pri tem je nastala tipična struktura med inverznimi ponovitvami, ki jo imenujemo 'stem-and-loop' (steblo in zanka).

Kasnejši poskusi, opravljeni v številnih laboratorijih, so pokazali, da se deli DNA, ki nosijo gene, ki kodirajo najrazličnejše lastnosti odpornosti na antibiotike, lahko prenašajo med molekulami DNA kot diskretne enote. Poleg tega se je izkazalo, da so se sposobni prenesti tudi geni, ki kodirajo druge lastnosti, kot so odpornost na strupene spojine živega srebra, sinteza bakterijskih toksinov in sposobnost fermentacije sladkorjev ali presnove ogljikovodikov. Katerikoli gen vstavimo med dva transpozicijska elementa, se lahko prestavi na drugo DNA s pomočjo transpozicije.

Združevanje nehomolognih delov DNA in premikanje genov med njimi pa nista edini sposobnosti transpozonov. Lahko tudi spodbujajo preureditev genetskih informacij na kromosomih in delecijo genskega materiala. To je dokazal Austin Taylor, ko je preučeval poseben bakterijski virus, ki ga je poimenoval Mu. Ime, ki pomeni »mutator«, izvira iz njegove lastnosti, da se lahko vstavi na več mestih v kromosomu in povzroči različne vrste mutacij v gostiteljski bakteriji. Ugotovili so, da je Mu v resnici transpozicijski element, ki lahko obstaja tudi kot infekcijski virus. V virusnem delcu je njegova DNA vstavljena med dva segmenta bakterijske DNA, ki izvirata iz bakterijskega kromosoma. Ko Mu okuži novo celico, »odvrže« ta segmenta bakterijske DNA in se vstavi na mesto v novem gostiteljskem kromosomu. Njegova sposobnost replikacije je tesno povezana z njegovo sposobnostjo transpozicije.

Ugotovili so, da Mu lahko katalizira kromosomske preureditve. Ta proces vključuje združitev dveh ločenih in neodvisno podvajajočih se molekul DNA, transpozicijo delov bakterijskega kromosoma v plazmide, delecijo DNA in inverzijo delov kromosoma. Te preureditve vključujejo nukleotidna zaporedja na koncih DNA virusa Mu in zahtevajo izražanje njegovega gena, ki je potreben za njegovo transpozicijo in replikacijo. Dodatni eksperimenti so pokazali, da delecijo DNA spodbujajo tudi drugi transpozicijski elementi, prav tako pa lahko povzročijo inverzijo zaporedij DNA.

Odkritje mehanizma transpozicije

Osrednja lastnost, ki je nakazovala, da transpozicije potekajo po drugačnem mehanizmu kot predhodno znana homologna rekombinacija v bakterijah, je bilo dejstvo, da so se insercije dogajale na popolnoma različnih mestih. Posledično je bila ena izmed prvih ugotovitev na področju raziskav mehanizma premikov transpozicijskih elementov, da do insercij teh nenavadnih zaporedij DNA pride tudi v odsotnosti gena recA, ki je sicer nujen za bakterijsko rekombinacijo. Z opazovanjem prenašanja odpornosti na antibiotike so ugotovili, da se vsak transpozicijski element lahko premika neodvisno od ostalih.

Prve raziskave mehanizma insercij oz. transpozicij so vključevale načrtno mutiranje različnih področij znotraj premičnih zaporedij. Pri tem so ugotovili, da mutacije znotraj inverznih ponovitev (IR) transpozicije popolnoma onemogočijo, medtem ko mutacije v območju med IR istega transpozona frekvenco transpozicij bodisi bistveno zmanjšajo bodisi v redkih primerih nekoliko zvišajo. Iz teh rezultatov je sledilo, da so inverzne ponovitve ključnega pomena za potek transpozicije in da zaporedje znotraj inverznih ponovitev istega insercijskega zaporedja najverjetneje zapisuje celični produkt, ki sodeluje pri premiku . Natančnejšo analizo transpozicijskih elementov in transpozicij je omogočil šele razvoj sekvenciranja nukleinskih kislin. Ob opazovanju IS1, Tn3, faga Mu in ostalih do tedaj znanih primerov so ugotovili, da insercije v tarčno zaporedje povzročijo podvojitev 5, 9 ali 11 baznih parov. Dotedanje ugotovitve so definirale zahteve, katerim so morali zadostiti prvi predlagani modeli transpozicijskega mehanizma – proces mora vključevati podvojitev direktnih ponovitev, mehanizem mora omogočiti fuzijo dveh sodelujočih molekul v eno samo, transpozoni pa naj bi po premiku ostali tudi na prvotnem mestu ali pa naj bi se tam regenerirali.

Eden izmed prvih modelov mehanizma transpozicije (simetrični model), ki ga je predlagal James A. Shapiro, je sestavljen iz štirih korakov:

1) Cepitev verig

Najprej nastaneta po dve prekinitvi na delu DNA s transpozonom in dve na DNA s tarčnim zaporedjem; prekinitve so na štirih različnih, temveč točno določenih mestih. Do prekinitve dvoverižne DNA pride le v eni verigi na posameznem mestu. V tarčnem DNA zaporedju se ustvarijo nekakšni lepljivi konci, v donorski DNA pa preloma nastaneta vsak na svoji strani transpozicijskega elementa.

2) Ligacija

Nastali fragmenti donorske in tarčne DNA se reorganizirajo v strukturo v obliki razpotegnjene črke X, kjer se na vsaki strani transpozicijskega elementa nahajajo replikacijske vilice.

3) Sinteza DNA

DNA polimeraza sintetizira manjkajoče nukleotide v tarčnem zaporedju in semikonzervativno podvoji transpozicijski element. Nastaneta dve – na mestu transpozicije – ločeni molekuli.

4) Rekombinacija

Zadnji korak je rekombinacija znotraj zaporedja transpozicijskega elementa, in sicer na mestu res. Rekombinacija je neodvisna od gena recA.

Prve tri korake so lahko pojasnili z analogijo z obstoječimi sistemi v celici, medtem ko je razlaga četrtega predstavljala največji izziv. Alternativa simetričnemu modelu je postal asimetrični model, kjer cepitev verig sprva poteče na le dveh mestih, sledi replikacija, ponovna cepitev in spet replikacija. S tem modelom so se izognili problemu razlage nehomologne rekombinacije, vendar je tudi slednji model imel svoje zadržke.

Kasneje so ugotovili, da transpozicijski elementi ključne encime za transpozicijo kodirajo kar sami – na obstoj transpozaze so kazale že spremembe v frekvenci transpozicij ob različnih kombinacijah mutacij. Na nekaterih transpozonih (npr. Tn3) pa so odkrili še en protein – poimenovali so ga resolvaza – ki je uspel razložiti četrti korak predlaganega simetričnega modela.

Danes sta v bakterijah eksperimentalno dokazana dva načina transpozicije, ki v nekaterih pogledih spominjata na prvotna modela.

Viri in literatura

1. Cohen, S. N. & Shapiro, J. A. Transposable Genetic Elements. Scientific American 242, 40–49 (1980).

2. Malamy, M. H., Fiandt, M. & Szybalski, W. Electron microscopy of polar insertions in the lac operon of Escherichia coli. Mol Gen Genet 119, 207–222 (1972).

3. Shapiro, J. The discovery and significance of mobile genetic elements. Mobile Genetic Elements -Frontiers in Molecular Biology (1995).

4. Shapiro, J. A. Mechanisms of DNA reorganization in bacteria. Int Rev Cytol 93, 25–56 (1985).